淋巴细胞分离.

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淋巴细胞分离与计数

淋巴细胞分离

原理:

外周血各种血细胞的密度不尽相同,利用淋巴细胞分层液(Ficoll)作密度梯度离心,使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。

实验材料:

淋巴细胞分离液

肝素

稀释液(生理盐水)

RPMI1640粉末

实验设备:1ml移液器、移液管、 5ml注射器、刻度吸管、EP管、离心机、显微镜

操作流程:

1. 在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2. 无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中,(每1ml全血加

0.1ml 125-250U/ml肝素溶液),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝

3. 稀释(外周血:稀释液=1:2 取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混

匀)

4. 用刻度吸管沿倾斜的管壁,把稀释血缓慢叠加于分层液面上,注意保持清

楚的界面(Ficoll:稀释血=1:2)

5. 放入离心机1500r/min 离心20min(注:缓慢加速1-4档个3分钟)

6. 用吸管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一离心管中,加入5倍以上

体积的稀释液(生理盐水),1500rpm×10分钟离心,洗涤细胞。

7. 重复洗涤一次,1500rpm×10分钟离心。

8. 末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞

9. 计数细胞后再调整细胞置所需浓度.

10. 取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个

大方格内的细胞总数。

单个核细胞浓度(细胞数/1毫升细胞悬液)=

4个大方格内细胞总数

────────── × 104×2(稀释倍数)

4

11. 分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。

注意事项:

1. 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞

2. Ficoll应适量,外周血应充分稀释

3. 温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果

4. 在Ficoll上加入稀释外周血时,应缓慢加,以免冲散界面

5. 吸取单个核细胞层时,应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污

淋巴细胞计数:

实验流程:

1. 准备计数板:

2. 制备细胞悬液:收集细胞,制成单个细胞悬液

3. 加样:用吸管轻轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液,

4. 计数:在显微镜下,用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数

5. 计算:将结果代入下式,得出细胞密度

胞数/毫升原

=(4大格细胞数之和/4)×104

注意事项:

1. 取样计数前,应充分混匀细胞悬液

2. 加样量不要溢出盖玻片,也不要过少或带气泡

3. 细胞压中线时,数上不数下,数左不数右

4. 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml

5. 镜下计数时,细胞数过少或过多,说明稀释不当,需重新制备细胞悬液、计数

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