反卷积简介

反卷积简介
反卷积是一种计算密集型图像处理技术，通过该技术，可以提高显微图像的对
比度和清晰度。

物镜数值孔径受限的情况下，这项技术主要是依靠一系列去模糊
处理技术来提高图像的质量。

基本上所有通过数码荧光显微镜拍摄的图像都可以反卷积处理。

还有一些新的
技术将反卷积应用在透射光图像中。

在所有反卷积技术的研究应用中，3D成像是
最常用到反卷积处理的。

图1标注了反卷积处理中需要用到的光学元件。

样品是
一个理想的细胞，由普通光学显微镜延Z轴获得一系列光切图（右图）重建形成。

在每一个焦平面上，相对应的平面图像被探测器记录并保存在计算机中。

在反卷积分析中，每一个焦平面上的图像被处理重建为一个3D图像。

反卷积技术常被认为是共聚焦显微镜的很好的替代品。

严格来说这种说法并不
准确，因为利用针孔光阑获得的共聚焦图像也可以用反卷积技术分析。

然而，文献中记载的大部分涉及反卷积技术的实验，都是应用于宽场荧光显微镜上的。

当今反卷积算法处理的图像可以跟共聚焦拍摄的图像相媲美。

事实上，共聚焦显微镜与宽场反卷积处理显微技术都可以去模糊，但工作原理是相反的。

共聚焦显微镜是通过安装在物镜和检测器之间的针孔光阑，来阻止非焦平面上
的模糊图像，而只有焦平面上的光可以通过。

相反，宽视场显微镜允许探测器接收到的所有光通过，随后利用反卷积技术对获得的图像去模糊处理。

共聚焦显微镜尤其适合观察厚的样品，比如胚胎或者组织；而宽视场反卷积显微镜很适合拍摄在非常低光水平的样品，比如荧光标记的活细胞和核酸。

图像降质的原因
图像降质可分为4个独立的原因：噪声，散射，眩光和模糊。

图2分别展示了
上述4种原因造成的图像效果。

反卷积技术的主要任务就是去除非焦平面上的模糊。

反卷积算法确实可以去除噪声，但只是整体上相对简单的去除。

1. 噪声。

噪声通常被描述为图像细节的拟随机紊乱（quasi-random disarrangement），最严重的形式就是白噪声（white noise）或者黑白相间噪声（salt-and-pepper noise），就是类似于电视中图像信号不好导致屏幕上的雪花点（图2(a)）。

这种类型的噪声被定义为拟随机，是因为如果噪声的来源是已知的，
那这种噪声的分布是可以预测的。

在数码显微镜中，噪声的主要来源是信号自身（光子噪声）或者成像系统。

噪声产生的两种原因已经了解，因此对噪声的分布统计也是可知的。

信号产生的噪声呈泊松分布（Poisson distribution），而成像系统产生的噪声常常呈高斯分布（Gaussian distribution）。

因为噪声产生的这两种原因已经了解的非常清楚，因此通过使用合适的图像过滤器可以很容易的去除，这在很多反卷积处理的软件中都可以做到，是一个可选的图像预处理过程。

2. 散射。

散射常指的是由于样品的异质折射率而引起的光的随机干扰。

散射会引起图像细节真正的随机紊乱，如图2（b）。

虽然样品中的散射并没有一个满意的预测方法，但是研究表明，散射的程度与样品的厚度和样品周围包埋材料的光学特性密切相关。

散射随着样品的厚度和样品内部结构的散射率异样性而增加。

3. 眩光。

与散射类似，眩光也是由光的随机扰动引起的，但常常由光学元件（如镜头、滤光片等）引起而不是样品本身。

当今的显微镜，通过对镜头和滤光片的抗反射涂层，镜头细化成像技术，光学用胶合剂和玻璃成分等的改进，眩光的程度已经降到最低。

图2(c)就是一个典型的眩光图像。

4. 模糊。

模糊是光通过成像系统的光学镜片组件时的非随机扩散引起的（图
2(d)）。

模糊产生的主要原因是光的衍射，仅仅由于模糊引起的图像分辨率受限，被称为衍射限制（diffraction-limited）。

它代表了任何一个成像系统固有的局限，而且是评价一个光学系统的像素有限性的决定性因素。

光学原理中阐述的非常复杂的模糊模型，在高速计算机的帮助下可以应用在光学显微镜的成像上。

这就是反卷积的基本依据。

因为模糊在反卷积中的基础重要性，它的理论模型在本文的其他段落有详细讨论。

然而，需要强调的是，所有的成像系统产生模糊，跟样品或者机械电子元件引起的图像降质形式完全无关。

这种光学模糊跟其他类型的图像降质无关，使得反卷积去模糊成为可能。

光和物体的相互作用主要源于物理现象，如散射、眩光和模糊。

但是，一个特定材料中的分子的组成和排列（无论是玻璃，水或者蛋白）都有特定的光学特性。

反卷积的目的，就是区分散射、眩光和模糊发生的位置及产生这些现象的数学模型的可能性。

因为散射在样品中发生位置不固定，所以被认为很难建模。

相反，因为
模糊是显微镜光学系统的作用，所以很容易建模。

这样的模型使得去模糊成为可能，反卷积可以使用这个模型去模糊。

点扩散因子（PSF）
模糊的模型上升到理论光学上是以3D点扩散因子的概念为基础的。

这个概念
是反卷积的重要基础，为了避免图像伪影，更需要深入了解这个概念。

点扩散因子是建立在样品空间的小点光源的无限扩散基础上。

因为显微成像系统在这一点上仅仅收集到部分发射光，而这种光不能完美的集中在3D图像的点上。

取而代之的是，这一点显示较宽而呈三维扩散方式。

因此，点扩散因子是用来形容一个理想点光源的3D衍射类型。

以已有的成像模式为基础（宽视场，共聚焦，透射光），点扩散因子有不同的
形状和结构。

在宽视场荧光显微镜中，点扩散因子的形状类似于被一团宽的光环包围的椭圆形足球。

为了在三维空间上描述点扩散因子，通常使用3轴坐标系统，
其中x和y轴是样品焦平面的坐标轴，而z轴与显微镜光轴平行。

在这种情况下，点扩散因子表现为一系列x-y轴同心的环，见图3。

在宽视场的点扩散因子中心的
x-y轴纵切图像中显示为一系列x-y轴同心的环，在经典的光学显微镜文献中被称
为艾里斑（Airy disk）。

两个x-z投影的点扩散因子显示出不同的球面像差（图3）。

光轴与图像垂直
的轴平行。

左图中的点扩散因子展示了最小的球差，而右图中的点扩散因子球差非常大。

需要注意的是，右图中，轴不对称和沿光轴中间的节点增宽，会引起轴向分
辨率的降低和信号的模糊。

理论上说，点扩散因子的大小是无限的，远离焦平面的总光强度与焦平面的光强度是相同的。

但是，光的强度降低很快，最终会变得跟噪声分不开。

使用高数值孔径的油浸物镜（1.40），无像差的点扩散因子，在焦平面占用0.2 μm2，扩散超过90次，在焦平面上下扩散到1mm范围内。

记录这些点扩散因子图片所用的样品是悬浮在甘油中（折射率=1.47）0.1mm直径的荧光点，镜
油的折射率在图中标示出来了。

点扩散因子如何影响成像是一个重要的考虑因素。

图像形成的理论模型将点扩
散因子作为图像的基本单元。

换句话说，点扩散因子对于图像来说相当于砖头对于房子的作用。

最好的图像就是点扩散因子的集合，增加放大倍数不会改变这个事实。

在《光学原理》一书（Born and Wolf: Principles of Optics）中有阐述“通过增加
目镜的倍数，并不会增加原始图中没有的细节，因为原始图像的每一个部分都是一个小的衍射图，而从目镜看到的实际图像是放大图像的集合”。

举例来说，要考虑在盖玻片和载玻片之间微小的荧光点的数量。

焦平面上的样
品图像呈星点云状，当用高分辨率观察时，每一个点实际上就是一系列小的同心环（图4(a)）。

如果稍微偏离焦平面，很多更大的同心环就会在刚才的成像位置显
示（图4(b)）。

在收集3D图像的时候，每一个荧光点的完整的点扩散因子被记录。

点扩散因子描述了通过成像系统中光的每一个点的情况。

模糊过程就是卷积的数学模仿。

卷积运算时描述样品中每一个点的点扩散因子。

来自每一个点的发射光是对点扩散因子的卷积运算，产生最后的图像。

不幸的是这个卷积出来会使样品图像变成模糊区域。

图像中每一个点的亮度与样品中每一个荧
光点的卷积运算线性相关。

因为点扩散因子是三维的，点扩散因子的模糊在三维图像中固有的。

任何一个焦平面的图像包含了该平面的点模糊和其他平面的点。

总的来说，图像的形成是由样品的点扩散因子的卷积计算获得的。

反卷积与这
个过程相反，试图从模糊图像中重建清晰图像。

点扩散因子中的像差
点扩散因子被定义为理论上利用衍射的数学模型，或者经验上获取荧光点的三
维图像（见图3）。

一个理论上的点扩散因子通常有轴向对称和径向对称。

实际上，点扩散因子是在x-y轴上面或者下面的对称（轴向对称）和z轴对称（径向对称）。

一个经验上的点扩散因子可以有完美的对称衍生出（见图3）。

这种衍生，通常指
的是像差（Aberration），由成像系统光学套件中任何一个部分的不规则或不对称
引起，尤其是物镜，但是其他部分也能引起像差，比如，反射镜、分光器、滤光片、光阑、孔径等。

光学组件的质量越好，经验点扩散因子越能接近理想的对称状态。

共聚焦和反
卷积显微镜技术中的点扩散因子都与理想值非常接近。

很多有经验的专业显微镜使用者都了解，光学显微镜中最常见的像差是球面像差。

球差表现为点扩散因子形状的轴向对称，尤其延z轴，同时大小增加，（图3）。

结果是分辨率和信号强度严重降低。

实际上，球差最常见的来源是由物镜前
镜头浸入的基质的折射率和样品浸入的基质决定。

如何减少无处不在的像差至关重要。

虽然反卷积技术可以部分恢复失去的分辨率，但是，即使再多的图像处理过程也不能恢复丢失的信号。