微生物的化学诱变技术

微生物的化学诱变

化学诱变：利用化学物质对微生物进行诱变，引起基因突变或真核生物染色体的畸变称为化学诱变。化学诱变的物质很多，但只有少数几种效果明显，如烷化剂、吖啶类化合物等。

复合处理及其协同效应：诱变剂的复合处理常有一定的协同效应，增强诱变效果，其突变率普遍比单独处理的高，这对育种很有意义。复合处理有几类：同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂先后使用，两种或多种诱变剂同时使用。

定向培育和驯化：定向培育是人为用某一特定环境条件长期处理某一微生物群体，同时不断将他们进行移种传代，以达到累积和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。由于自发突变的变异频率较低，变异程度较轻，故变异过程均比诱变育种和杂交育种慢得多。

微生物化学诱变的操作过程

化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。

化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，移取液体时绝对禁止直接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防止污染环境，造成公害。

一、碱基类似物

用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5-IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。最常用是5-BU和AP。

当将这类物质加入到培养基中，在繁殖过程中可以掺入到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，困此，也叫掺入诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必顿处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。

（一）碱基类似物的诱变机制

正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。

5-BU导致A:T碱基对转换为G:C碱基。

2-氨基嘌呤也可以诱发DNA分子中A:T－G:C或G:C－A:T的转换。

（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）

1．单独处理

将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8~10 h，消耗其体内的贮存物质、将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25~40 μg/mL，温合均匀，取0.1~0.2 mL菌悬液加入到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为0.1 mg/mL。

2．与辐射线复合处理

据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用射线要好。因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂，从而提高突变率。

二、烷化剂

（一）烷化剂的作用机制

烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂含有硫芥、氮芥。

烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10%左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。

烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。

（二）烷化剂的性质

溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液pH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的缓冲液。千万要注意烷化剂有毒！！！！

（三）常用的烷化剂

亚硝基胍（NTG）：黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄色变为绿色时，诱变效应际低。有超诱变剂之称，常用缓冲溶液有磷酸缓冲液和Tri缓冲液。

诱变处理方法：

①用一定值的磷酸缓冲液或Tri缓冲液洗制成菌悬液。②NTG母液：配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲液，其比例为缓冲液9 mL:NTG丙酮溶液l mL，浓度为NTG 1 mg/mL；使用时取母液0.2 mL + 菌悬液1.8 mL，NTG终浓度为100 μg/ mL。一般随菌种不同而异，细菌一般为100~1000 μg/ mL，放线菌、真菌为l000-3000 μg/ mL。③放线菌在生长适宜的温度下培养，（细菌30~35℃、真菌25~28℃、放线菌30~32℃）处理若干时间，一般细菌20~60 min，孢子90~120 min。④终止反应。冷的生理盐水50倍稀释处理，或经过离心洗涤处理，作一定稀释度分离于平皿。如果是细菌，把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中，振荡培养1.5~2 h，经2~3次细胞分裂，再涂平皿。

处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH浸泡处理。

NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理。⑴摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加入5~10 μg/mL NTG．并加几滴吐温60或吐温80，使成乳化状（注意吐温对该菌生长是否有影响）；⑵在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板，NTG浓度为10~50 μg/mL。或将琼脂培养基制成平板．然后将NTG和菌

体混合涂抹平板，此时NTG浓度为10~20 μg/mL。

经后培养的培养液，除部分进行平皿分离外，剩余的培养液可以加入适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50%甘油（最终浓度为12.5%）于-40℃、-80℃保存。在以后数天内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。

据报道，无论是用辐射处理，还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或后增养液，浸在冰浴中2~3 h，试验的重复性很好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果。

NTG是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理。可用大量自来水冲洗或用1~2 N的NaOH浸泡过夜后再用大量自来水洗净。

2．甲基磺酸乙酯（简称EMS）

甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效果较好的一种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于水，不稳定，易水解成无活性物质。

EMS的诱变处理方法：

① EMS 母液的配制：为了安全和防止失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取0.5ml EMS原液，加入到10 mL pH7.2磷酸缓冲液中，加盖，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并要现用现配。

②取新鲜的菌体，经前培养至对数期，离心洗涤，用缓冲液制成8 mL菌悬液（107~108/mL）。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，悬液含106/mL。

③取EMS母液2mL，加入到8mL的菌悬液中。在适宜温度下处理一定时间（根据预实验结果确定）。处理的最终浓度为0.l mol/L。对于真菌孢子，则为0.2~0.5 mol/L。

④EMS处理一定时间后，用50倍生理盐水稀释或加入一定量的2% NaS2O3溶液或多次离心、洗涤，以终止反应。

EMS是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10% NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。

三、脱氨剂

亚硝酸是一种常用的诱变剂。毒性小，不稳定，易挥发，其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO和NO2。

（一）亚硝酸的诱变机制：脱去碱基中的氨基变成酮基，引起转换而发生变异。A→H，C→U，G→X。A:T→G:C和G:C→A:T。亚硝酸的诱变也可以发生回复突变。

亚硝酸除了脱氨基作用外，还可引起DNA交联作用，DNA复制，从而导致突变。

（二）亚硝酸的处理方法

1．试剂的配制

（1）称8.2克乙酸钠溶于适量水中，加入6.0克冰乙酸，然后转移到100 mL的容量瓶中，用少量水洗涤烧杯2到3次，洗液并入容量瓶中，再定容到刻度线即可。