第三章细胞工程.doc

课程名称：现代生物技术概论

授课主题：第三章细胞工程

授课教师：生命科学系王国霞

目的要求：

1，了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。2，学习如何进行动植物细胞及组织的培养方法。

3，探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。

4，掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。

内容重点：植物细胞工程、动物细胞工程

内容难点：动物细胞工程、细胞融合

第三章细胞工程

细胞工程是在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程。是现代生物技术中涉及面极为广泛的一门工程技术，它与基因工程一起代表这现代生物技术的最新发展前沿。

概念：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，以获得某种有用物质的一门综合性科学技术。

按研究对象可分为：植物细胞工程、动物细胞工程、微生物细胞工程

按技术水平分为：动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术。

第一节细胞工程的基础知识与基本技术

一，基础知识

细胞是细胞工程的操作对象。是生命结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单元。

细胞英文名:CELL 在文章中简称C。细胞并没有统一的定义，近年来比较普遍的提法是：细胞是生命活动的基本单位。

组成细胞的元素：

①组成细胞的最基本的元素是C。在人体细胞干重中C的含量达到55.99%

②组成细胞的基本元素有4种：C、H、O、N。在细胞中这四种元素的含量，占组成细胞元素总量的90%左右。

③组成细胞的主要元素有6种：C、H、O、N、P、S。这6种元素占细胞总量的97%。

二，基本操作技术

三个关键的的操作技术：无菌操作技术、细胞培养技术、细胞融合技术（一）无菌操作技术

细胞工程的所有操作都是在无菌条件下进行的。

1，细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。

2，基本设备配制

基本设备冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。

灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操作设备净化工作台、接种箱。

光温控制设备时间程序控制器、空调及温度感应器。

细胞培养设备培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。

细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。

除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。（二）细胞培养技术

细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。

1，取材和除菌。植物材料在取材后，动物材料在取材前都要进行严格的表面清洗，消毒。

2，要根据各类材料的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。

3，接种，采用无菌操作技术，将材料接种与培养基上。

4，培养，最后将接种后的培养基放在培养室或培养箱中，提供细胞生长所需的最佳培养条件，如温度、湿度、光照、氧气及二氧化碳等。

（三）细胞融合技术

两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等

遗传物质重组的过程称为细胞融合。

1、制备原生质体。微生物和植物细胞外面有坚硬的细胞壁，通常需要用酶进行降解。动物细胞不需要。

2、诱导细胞融合。两亲本细胞（原生质体）的悬浮液调至一定细胞浓度，按1：1的比例混合后，逐渐滴入高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导融合，或用电激法促进融合。

3、融合细胞的筛选。将混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细胞无法长出。

第二节植物细胞工程

包括植物组织培养、植物细胞培养、次生代谢物的生产、人工种子的研制。

一，植物组织培养

定义：在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）条件下，培养和研究植物组织、器官，甚至进而从中分化、发育出整株植株的技术。

（一）理论依据

理论基础就是植物细胞具有全能性。

细胞的全能性：离体的体细胞或性细胞在一定的培养条件下，可以长出再生植株，再生植株具有与母株相同的全部遗传信息。

植物细胞全能性的概念是1902年由德国著名植物学家Haberlandt首先提出的。并设想一个体细胞可以被人工培养成一个胚。

哈伯兰德被誉为“植物组织培养之父”。

（二）培养过程

1预备阶段

（1）外植体的选择

外植体选择部位要是去分化相对容易的部位，一般以幼嫩的组织或器官为宜。（2）外植体的灭菌

除菌的一般程序：

外植体——自来水多次漂洗——消毒剂处理——无菌水反复冲洗——无菌滤纸吸干——无菌外植体

切割成小块外植体——放置于培养基进行培养

灭菌的时间和消毒剂的选择要根据外植体的情况进行选择，通常对幼嫩组织消毒的时间要比成熟组织的短。

（3）配制培养基

总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有机化合物；生长调节剂三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。

A无机盐类

大量元素：C,H,O,N,S,P,K,Ca,Na,Mg等

微量元素：Mn,Zn,Cu,B,Mo,Fe；

有机化合物

糖类、维生素、腺嘌呤、氨基酸、植物激素

其它

天然提取物如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物)，琼脂，活性炭

2，诱导去分化阶段

材料除菌后，切成小片段插入培养基即可，可采用①固体培养基，这种方法简便易行，占地面积小，可多层培养。但会出现极化现象：愈伤组织过早分化出芽和根；②液态培养，营养吸收快捷，需要震荡设备，一旦污染后果严重。3，继代增殖阶段

移植扩增分割继代

必须通过继代增殖，才能使愈伤组织的细胞数大量扩增。

4，生根成芽阶段

再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成根或芽等器官。

愈伤组织只有通过重新分化才能形成胚状体，继而长成小植株。要移植到汗适量细胞分裂素和生长素的分化培养基中，才能诱导胚状体的生成。光照是本阶段必须的。