融合蛋白表达实验报告

基因构建与表达实验报告

实验一目的基因扩增与纯化回收

一、聚合酶链式反应

实验目的：通过PCR反应将目的片段扩增出来，获得足量的目的片段。

实验原理：DNA双螺旋在90-95℃解链形成单链；50-55℃引物与单链结合；70-72℃TaqDNA 聚合酶从结合在模板上的引物出发，以dNTP为原料，按碱基配对方式，从5’—3’方向合成新的DNA链。经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。

实验仪器和材料：PCR仪PCR管移液器tip枪头

实验试剂：

双蒸水（ddH2O）

10×PCR缓冲液(含Mg2＋)

4种10×dNTP 混合

Taq酶（Easy Taq）

DNA模板

两种引物（上游和下游）

实验步骤：

试剂ddH2O Easy Taq

Buffer dNTP Easy

Taq酶

甘油上游

引物

下游

引物

DNA

模板

100ul大

体系

6510100.210222

注：一般情况下先依次加入ddH2O、10×Buffer、10×dNTP、Easy Taq酶、甘油配体系分装到PCR管中（100ul/管），再加入对应的上下游引物和模板

2、放入PCR仪，按照实验设计的温度进行PCR，反应参数如下：

(1) 94℃预变性4min；

(2) 94℃变性1min；

(3) 55℃退火1.5min；

(4) 72 ℃延伸2min；

(5) 重复(2)-(4)30个循环；

（6）72 ℃终延伸10min；

二、琼脂糖凝胶电泳检测

实验目的：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA分子量的大小，检测目的基因片段是否扩增出来。实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性溶液中带有负电荷，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。溴化乙锭（EB）可插入到DNA分子的相邻碱基之间，在紫外光的照射下出现荧光，从而指示DNA含量和位置。

实验仪器：电泳仪、紫外检测仪、水平电泳槽、移液枪、一次性手套

实验试剂：TAE 、EB溶液、凝胶加样缓冲液、琼脂糖

实验步骤：

1、1%琼脂糖凝胶的制备（以制备5块胶为例）：

（1）称取琼脂糖1.6g，加入160ml 1 x TAE缓冲液，在微波炉上加热溶解煮沸熔化，取出摇匀至无沉淀。

（2）取有机玻璃内槽，放置于水平位置，用移液枪吸取少量胶将有机玻璃内槽两端密封。冷却到60℃左右（手感温度不烫手即可）加入7ulEB溶液，摇匀后倒入有机玻璃内槽，等距插入5个样品梳子。

（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液没过胶面。

2、加样

用移液枪取缓冲液，依次点3ul缓冲液在点样板上，再取PCR样品溶液10ul左右与缓冲液混匀后，加入样品孔中，并记录好点样顺序。（大体系PCR产物需要回收，点样时更换枪头避免交叉污染）

3、电泳及结果观察

接通电泳槽与电泳仪的电源，170V恒压电泳20min，电泳至溴酚蓝接近胶底部边缘即可；电泳完毕，取出凝胶，放在紫外灯下观察DNA条带的位置，根据DNA条带与溴酚蓝的相对位置估算DNA分子量大小，记录结果。

三、DNA片段回收：

1、摇匀GS树脂，用移液枪取500ul树脂分装于1.5mlEP管中，将PCR大体系产物加入到GS树脂中，用移液枪吹打混匀，静置10min，让片段结合到GS树脂上

2、将混合液转入纯化柱中，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体

3、加600ul80%异丙醇洗脱两次，13000rpm瞬时离心，弃收集管中液体，13000rpm空甩20min ；取出回收柱放入干净的1.5mlEP管中，放入30-40摄氏度烘箱烘干10min左右，使异丙醇完全挥发。

4、取出加入50ul ddH2O浸润树脂干粉，静置10min让ddH2O充分浸润树脂干粉，13000rpm 离心2-3min，得到的PCR产物用于双酶切。

实验结果：

实验二DNA双酶切及酶切产物纯化

实验目的：

通过DNA限制性内切酶对DNA双链进行双酶切，使DNA片段露出相应的粘性末端。

实验原理：

1、核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭，具有自我保护机制。一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点上以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，切割DNA分子。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响酶切反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。

2、Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，其优点是：只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；此类酶作用时只需要Mg2+参与，无需ATP。

3、DNA双酶切可有效防止载体自连形成空载体，双酶切应选择公用的Buffer

实验仪器和材料：PCR仪、PCR管、移液枪、tip枪头、限制性内切酶

实验步骤：取5ul通用酶切buffer Tango，加入1ul限制性内切酶1和1ul限制性内切酶2，将PCR回收产物全部（大约43ul）加入混匀，体系配好后盖上PCR管并做好编号，放入PCR仪中，设定37℃酶切过夜。用含有GS结合液的树脂纯化酶切产物，操作方法同PCR 产物回收方法。