环境雌激素的识别

环境雌激素环境雌激素的识别的识别

为了更全面更深入的研究内EEs 并评价其对人类和动植物的危害，有必要对其进行检测和鉴别，探讨EEs 与出生缺陷的因果联系，识别环境污染物中的EEs 。

（一） 物理检测技术

物理检测一般是用色谱仪器（如液相色谱和气相色谱）进行分析。色谱分析技术对含EEs 样品的前处理过程要求较高，需要从复杂的基质样品中将低浓度的目标化合物高效提取、纯化和浓缩。随着色谱检测技术与质谱检测技术的结合，检测分析的选择性和灵敏度得到了很大的提高，检测范围进一步扩大。 总之，做为色谱分析前处理的萃取只能提取一类或几类物理性质相似的EEs ，而要完全分析样品，必须采用不同的萃取、纯化方法分别提取与分析，因此耗时较长，费用也较大。

（二） 生物检测技术

生物检测是建立在EEs 在体内的作用机制及产生的生物效应的基础之上的。生物检测包括体内实验（In vivo test ）与体外实验（In vitro test ）。

1. 体内实验

体内实验主要包括哺乳动物实验、非哺乳类脊椎动物实验（包括鸟类实验、两柄类实验和鱼类实验等）、无脊椎动物实验（包括蚤类实验、糖虾繁殖实验等）（宋福永 等，2004）。在动物实验中，目前所用的受试动物主要为啮齿类动物，如大鼠、小鼠等。方法有子宫增重大实验、阴道细胞涂片实验、雌性动物青春期实验、雄性动物青春期实验、睾丸摘除实验、两代繁殖实验等。

子宫增重大实验是检测雌激素活性的经典方法，选用未成年或成年后切除卵巢的雌性大鼠或小鼠，连续皮下注射受试物或较长时间饲以含有受试物的食物，一段时间后处死动物，迅速剥离子宫，称取子宫的湿重和（或）干重，计算子宫脏器系数，测定子宫过氧化酶的活力，检测子宫血管渗透性等，用这些指标的变化大小综合评定受试物的雌激素样活性与强度（宋福永 等，2004；王涛 等，2004）。

啮齿类动物青春期实验分别以未成熟的雄性或雌性动物暴露于EEs ，通过检测雌性动物性器官和第二性征的发育，来评价化合物的雌激素活性。哺乳动物两代繁殖实验则是研究化合物对哺乳动物的剂量反应特性以及繁殖发育的负效应（宋福永 等，2004）。

阴道细胞涂片实验是以动情周期为4天的大（小）鼠为试验对象，切除卵巢12周内对其进行染毒后观察阴道细胞的角化情况（染毒后在48小时～72小时内发生角化）。该法特异性较高，但与子宫增重法相比。灵敏度不高。对产卵脊椎动物如鸟、鱼、爬行动物和两栖动物等。可通过检测动物体内的卵黄蛋白素的合成来确定有无内分泌干扰活性。

2. 体外实验

体外实验主要有细胞培养实验、受体结合实验、体外芳香酶活性抑制实验、分子生物学检测技术等几种（宋福永等，2004；王涛等，2004）。体外实验的设计主要根据EEs在体内的作用机制，如类雌激素在体内与17β-雌二醇竞争结合雌激素受体。

细胞培养实验是利用细胞对雌激素或具有雌激素样作用的物质可产生特异性反应，通过观察细胞生长曲线或测定特异性蛋白含量，来判断受试物的雌激素活性和强度。用细胞培养法检测内分泌干扰物的方法主要有：MCF-7细胞增殖试验、酵母报告基因试验和哺乳动物细胞报告基因试验。所用的细胞系ZR-75-1细胞（此三者皆为人乳腺癌细胞系）、有MCF-7细胞、T47D细胞、Hela细胞（人宫颈鳞癌上皮细胞系）、大鼠子宫原代细胞、大鼠垂体原代细胞、鼠淋巴细胞经基因转染的Lec-9细胞等。而细胞增殖常用的是MCF-7细胞（解玮等，2004），优点在于能反映EES对人体的作用，且操作简单、灵敏度较高。而细胞特异性产物测定常用的是卵黄蛋白原（vitellogenin，VTG）。由于卵黄蛋白原具有高度的特异性、高度的灵敏性及标本的取材灵活广泛等特点，所以在雌激素鉴别中，可以作为很好的生物标志物（biomarker）（周庆样等，2003）。

MCF-7细胞增殖试验将MCF-7细胞培养在含有经5％活性炭，葡聚糖处理的胎牛血清和含不同浓度受试物的培养基中，以17β-雌二醇为对照，6天后终止培养，磺基罗丹明B（SRB）染色，用酶标仪在540nm读取吸光值，采用相对细胞增殖力（引起细胞最大增殖时的雌二醇浓度／产生相同增殖效应时内分泌干扰物浓度）或相对细胞增殖效应（内分泌干扰物引起的最大细胞增殖占雌二醇引起的最大细胞增殖的百分比）为评价内分泌干扰效应的指标（Payne J 等，2000）。

酵母报告基因试验酵母细胞属于真核细胞，易培养，对环境中许多有害物质具有一定的抵抗力。根据这两点，研究者利用基因重组技术将构建成功的雌激素受体(人或动物的特异性受体)酵母表达载体和雌激素效应元件调控的酵母报告基因（β-半乳糖苷酶）载体导入酵母细胞建立重组酵母筛选系统，利用转基因酵母菌株，可采用摇瓶法、96孔板法和单板法筛选有内分泌干扰活性的化学品，计算β-半乳糖苷酶活性（U），根据Hill方程（周廷冲，1985）计算雌激素浓度为[A]时效应的最大值（E Amax）和半数有效浓度（EC50），用来反映

物质诱导β-半乳糖苷酶活性升高的内在活性和与受体的亲和能力，即该物质的内分泌干扰活性。该试验在国内应用广泛，用来筛选内分泌干扰物和检测自来水、地表水及其底泥的雌激素活性。

哺乳动物报告基因试验该试验是目前较常用的内分泌干扰物筛选方法，但国内使用较少。将含有雌激素反应元件转录控制的报告基因质粒转入细胞，如果细胞无内源性受体或内源性的受体不能有效地进行反式激活，还要转入一个相关的激素受体表达载体。也可以转入嵌合体受体载体和报告基因质粒，常用的嵌合体系统是Ga14-HEC0结构。报告基因质粒转染方式有两种，稳定转染和暂时转染，一般来说，暂时转染细胞系对受试物应答性高，稳定转染细胞系相对来说应答性较低但是对大规模检测来说经得起考验。常用的报告基因有两类：①荧光素酶基因（Luc）以荧光素的化学发光效应来衡量内分泌干扰物的活性，②氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因以酶活性来衡量内分泌干扰物活性。报告基因质粒中含两个重叠ERE （over ERE）时，系统的灵敏性提高，例如，使用over ERE检测到除草剂禾草灵（Ⅲoxan）在10 µmol／L时具有雌激素活性，而使用单个ERE时，在Ⅲoxan为100µmol／L时才有转录活性的升高。另外，一些化合物在使用单个ERE时，未显示出有雌激素活性，而在使用over ERE 时，才显示出活性，例如氨基甲酸。

受体结合实验如雌激素受体结合实验,是从受体水平上判断某物质是否具有雌激素活性及其活性强度。受体结合实验可以了解EEs的作用是否经过受体所介导，来区分被测物是激素的激动剂还是拮抗剂。

EEs已经严重威胁到人类的健康和繁衍，但EEs的本质和效应还尚未完全清楚。这就要求要有更多的实验和研究，去证实EEs与出生缺陷的关联性、确定出生缺陷的检测标准，去揭示它们之间的作用机制、EEs作用的关键期和敏感期以及提出预防和治疗措施，为更加有效地控制EEs、更好地保护人群提供确凿的科学依据和政策策略。