蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
实验二 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
二、血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
清蛋白 血 清 球蛋白 β γ pI=7.3 9%～11% 12%～18% >150kD α1 pI=4.9 60%～70% 2%～3.5% 69kD
α2
pI<6
4%～7%
分离依据：蛋白质理化性质的共性和个性
共性：
*生命大分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液有胶体性质：稳定因素为水化膜和电荷→ 盐析/有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH>pI，蛋白质带负电；反之带 正电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→免疫沉淀
血清电泳结果
清蛋白（albumin，A）：38～48g/L
球蛋白（globulin，G）：15～30g/L
A/G：正常值1.5～2.5
电泳鉴定
清蛋白 1 2
γ 加样线
对照
纯化γ蛋白 加样线 样品
注意事项
1.盐析：滴加硫酸铵时边摇边逐滴加入 2.离心：小试管离心，加套管配平。（参考视频） 3.层析：上样（转圈滴加）；防止柱床液层干涸；收集
蛋白样品时用载玻片加磺柳酸检测；凝胶再生。
4.浓缩：G-200干胶用纸条少量多次加入，液层高<0.5ml；
用过的G-200干胶倒入收集烧杯，回收利用。
5.电泳：区分正反面；血清点一次，纯化蛋白点3-5次；
点样面朝下，在负极。（参考视频）
预实验结果
凝胶层析原理
大分子：垂直向下运动
流程短
小分子：垂直向下运动 不定向扩散
流程长
交联葡聚糖凝胶
多聚葡萄糖与环氧丙 烷交联而成，网状结 构。珠状颗粒，商品 名为Sephadex G系列。
关于纯化的实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质纯化的操作技术。
3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。
二、实验原理蛋白质纯化是指从复杂的蛋白质混合物中分离出目标蛋白质的过程。
常用的蛋白质纯化方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
本实验采用盐析法对蛋白质进行初步纯化，并通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色对纯化效果进行鉴定。
三、实验材料1. 蛋白质样品：酶溶液、标准蛋白质样品2. 试剂：硫酸铵、SDS-PAGE电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250、Tris-HCl、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、琼脂糖、双蒸水等3. 仪器：电泳仪、紫外观察分析仪、离心机、移液器、烧杯、玻璃棒、滴管、剪刀等四、实验步骤1. 盐析法纯化蛋白质（1）将酶溶液与硫酸铵溶液按照一定比例混合，室温静置一段时间。
（2）离心分离，收集沉淀。
（3）将沉淀用双蒸水洗涤，去除杂质。
（4）将洗涤后的蛋白质沉淀溶解于适量的双蒸水中，得到初步纯化的蛋白质溶液。
2. SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果（1）配制10%的琼脂糖凝胶，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液。
（2）将标准蛋白质样品和纯化后的蛋白质样品进行电泳分离。
（3）关闭电源，取出琼脂糖凝胶，用考马斯亮蓝G250染色。
（4）观察电泳图谱，比较纯化前后蛋白质的条带变化，判断纯化效果。
五、实验结果与分析1. 通过盐析法纯化蛋白质后，SDS-PAGE电泳图谱显示，蛋白质条带较纯化前明显减少，表明蛋白质纯化效果较好。
2. 纯化后的蛋白质条带与标准蛋白质样品的条带基本一致，进一步说明纯化效果良好。
六、实验结论本实验通过盐析法对蛋白质进行初步纯化，并采用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行鉴定。
结果表明，蛋白质纯化效果较好，达到了实验目的。
七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、经济、有效的蛋白质纯化方法，适用于初步纯化。
2. 实验过程中，蛋白质沉淀的收集和洗涤是关键步骤，直接影响纯化效果。
蛋白质分离纯化及鉴定
浓缩胶缓冲液 水
分离(fēnlí)胶 (8%) 浓缩胶 (4%)
1.25 ml
/
/
0.5 ml
2.4 ml
1.2 ml
TEMED
10 ul
5 ml
AP
60 ul
25 ul
第二十四页，共27页。
2.2 样品处理 适量浓度蛋白溶液加入1×上样缓冲液混匀，
95℃水浴中处理5分钟。
2.3 加样 用微量进样器取10-15 l上述(shàngshù)混合液，通过 电极缓冲液，小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。 2.4 电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接， 打开电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离 胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框1 cm时，停止电泳，关闭电源。
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围
104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105
适用的凝胶浓度/(%)
20-30 15-20 10-15 5-10 2-5
第十七页，共27页。
1.3 种类
1) 连续系统与不目前常用(chánɡ yònɡ)的多为圆盘电泳(图1) 和板状电泳(图2)，两者电泳原理完全相同。
第十页，共27页。
5. 样品 上柱、洗脱、 (yàngpǐn) 收集。
a. 如图装好层析装置，打开下端(xià duān) 出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶 面
b. 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端 出口，使样品溶液流出至刚好达到凝 胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱 壁。
c. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收集，
4.样品槽模板 5.固定螺丝(luó sī) 6.上贮槽 微型(wēixíng)电泳系统
蛋白质的提取、分离纯化及定量
实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法实验目的1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。
可根据R f 作为定性依据。
Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。
将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。
取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风实验步骤1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。
在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
11.6 生化实验报告 血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析
血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验目的】1、了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离子交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋白质的方法。
【实验原理】1、蛋白质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒子使蛋白质周围的水化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的一种。
向蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析出，这种作用就叫做盐析。
盐析不能使蛋白质变性，可以复原。
利用这个性质，可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。
蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。
同时，离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，蛋白质溶解度更加降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。
由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
由于清蛋白的亲水性比球蛋白大，且清蛋白的分子比球蛋白小，所以清蛋白需要高浓度的盐溶液才能够发生盐析，低浓度的时候球蛋白发生盐析。
盐析法分离蛋白质：各种蛋白质的颗粒大小、亲水程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不一样。
调节盐浓度可使不同的蛋白质沉淀，从而达到分离的目的。
常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，盐析效果好，不易引起变性。
可用硫酸/氨水按需要调节pH值。
本实验中清蛋白分子小，亲水性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，而球蛋白分子大，亲水性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。
2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。
3、了解柱层析技术。
二、实验原理1、粗提（盐析法）：蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。
当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。
盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。
由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。
2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。
而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。
从而可达到去盐的目的。
3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。
带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。
本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。
血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。
蛋白质纯化实验步骤
蛋白质纯化实验步骤引言:蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。
蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。
下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。
一、样品制备在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。
样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。
样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。
二、离心将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。
离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。
三、初步分离将离心后的上清液取出，进行初步分离。
可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。
这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。
四、亲和层析亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。
亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。
五、凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。
凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。
六、柱层析柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。
柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。
七、透析透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。
透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。
八、浓缩浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。
常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据蛋白质的分子量和颗粒大小来选择合适的浓缩方法。
九、纯化验证在蛋白质纯化实验结束之后，需要对纯化后的目标蛋白质进行验证。
蛋白质的鉴定实验报告
蛋白质的鉴定实验报告
《蛋白质的鉴定实验报告》
在生物化学实验室中，蛋白质的鉴定是一项非常重要的工作。
蛋白质是生命体系中的基本组成部分，它们在细胞内发挥着重要的功能，因此对蛋白质的鉴定需要精确的实验方法和技术。
本次实验旨在利用凝胶电泳技术对样品中的蛋白质进行鉴定。
首先，我们需要将待测样品进行蛋白质提取，并进行浓缩和纯化处理。
接着，利用凝胶电泳技术将样品进行分离，根据蛋白质的大小和电荷特性，我们可以清晰地观察到不同蛋白质的迁移情况。
最后，通过染色和显影处理，我们可以对蛋白质进行定量和定性分析，从而得出样品中蛋白质的组成和含量。
在实验过程中，我们需要严格控制实验条件，确保样品的处理和分离过程不受外界因素的干扰。
同时，对实验结果进行准确的解读和分析也是至关重要的。
只有通过科学的实验方法和严谨的数据处理，我们才能得出可靠的蛋白质鉴定结果。
通过本次实验，我们成功地对样品中的蛋白质进行了鉴定，并得出了详细的实验报告。
这些数据和结果将为我们进一步研究蛋白质的功能和作用提供重要的参考和依据。
同时，我们也不断总结和完善实验方法，以提高蛋白质鉴定的准确性和可靠性。
总之，蛋白质的鉴定实验是生物化学领域中的重要工作，它为我们深入了解生命体系的基本组成和功能提供了重要的技木支持。
通过不懈的努力和实践，我们相信蛋白质的鉴定技术将不断得到完善和提高，为生命科学研究带来更多的突破和进展。
实验室蛋白纯化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在通过蛋白质纯化技术，对目的蛋白进行分离和纯化，获得高纯度的蛋白质样品。
实验采用亲和层析法，利用蛋白与特定配基之间的特异性相互作用进行纯化。
二、实验材料1. 蛋白质样品：含有目的蛋白的细胞裂解液或组织匀浆液；2. 亲和层析柱：选择合适的亲和层析柱，如Protein A、Protein G、亲和素等；3. 亲和配基：与目的蛋白具有特异亲和力的配基，如抗体、寡核苷酸等；4. 试剂：磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris-HCl缓冲液、咪唑、甘氨酸、牛血清白蛋白等；5. 仪器：离心机、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计等。
三、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和层析柱按照说明书进行预处理，如活化、平衡等；2. 样品预处理：将蛋白质样品在4℃下以12,000 rpm离心10分钟，取上清液作为待纯化样品；3. 样品上柱：将待纯化样品上柱，流速控制在1.0 mL/min；4. 洗脱：使用洗脱缓冲液进行洗脱，流速控制在1.0 mL/min，收集洗脱液；5. 蛋白质鉴定：采用SDS-PAGE和Western Blot对洗脱液进行蛋白质鉴定；6. 蛋白质定量：采用紫外可见分光光度计对洗脱液进行蛋白质定量；7. 蛋白质纯度鉴定：采用SDS-PAGE和Western Blot对纯化蛋白质进行纯度鉴定。
四、实验结果1. SDS-PAGE结果：在目的蛋白所在位置，观察到一条明显的条带，证明目的蛋白已从样品中分离出来；2. Western Blot结果：在目的蛋白所在位置，观察到特异性条带，证明目的蛋白已被成功纯化；3. 蛋白质定量结果：洗脱液中蛋白质浓度较高，证明目的蛋白已从样品中分离出来；4. 蛋白质纯度鉴定结果：纯化蛋白质的纯度达到95%以上。
五、实验讨论1. 实验过程中，样品上柱、洗脱等步骤的操作要尽量温和，避免蛋白质变性；2. 亲和层析柱的选择要合适，根据目的蛋白的特性和实验要求，选择合适的亲和配基；3. 洗脱缓冲液的离子强度、pH值等参数要优化，以提高蛋白质的回收率；4. 实验过程中要注意蛋白质的稳定性，避免蛋白质在纯化过程中发生变性或降解。
生物化学--蛋白质的分离纯化与鉴定
聚 ➢ SDS是一种变性剂，能够使蛋白质的肽
丙 烯
链伸展。
酰 ➢ SDS使多肽链带上相同的负电荷， 掩盖
胺 了不同种类蛋白质间的电荷差别，结果
凝 所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同
胶 电
样的电荷/蛋白质比向正极移动。
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二、 蛋白质分子大小与形状
泳 （ ➢ SDS与蛋白质结合，改变了蛋白质单体
第六节
蛋白质的分离纯化与鉴定
The Separation and Purification of Protein
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一、蛋白质的酸碱性质
蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外， 氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条 件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
* 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成
七 ） 蛋
X射线晶体结构分析。 ➢ 测定蛋白质分子在溶液中的摩擦系数可
白 以判断蛋白质分子的形状
质 分
蛋白质的摩擦系数 f=RT/ND
子 理想刚性球体的摩擦系数
的
形 状
f/f0是蛋白质分子的摩擦比
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二、 蛋白质分子大小与形状
（ ➢ 当摩擦比大于1.0时，蛋白质分子的形状
七 ） 蛋
➢ 待测样品可以不纯
➢ 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，可 选用不同分离范围的凝胶。
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二、 蛋白质分子大小与形状
泳 （ ➢ 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基
单元四：重组蛋白的分离纯化及检测
实验报告题目:单元四:重组蛋白的分离纯化及检测指导老师:王磊日期:2013/11/7-201311/9一．实验目的：1、学习亲和层析的原理；2、掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作；3、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；4、掌握SDS-PAGE分离蛋白质组分的操作方法；5、了解Western blotting的原理及其意义，掌握Western blotting的操作方法；6、应用Western blotting 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上的重组蛋白。
二．实验原理：(1)亲和层析：以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这种方法称为金属螯合亲和层析。
蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。
已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质。
在碱性pH时吸附更有效，但选择性降低。
金属螯合亲和层析在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。
本实验用IPTG诱导表达的蛋白质GFPuv是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标签，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：由丙稀酰胺单体（acrylamide)和交联试剂N，N’－甲叉双丙稀酰胺（N,N-methylene bisacrylamide)在催化剂存在的情况下聚合而成的三维网状结构的凝胶，改变单体的浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径大小的凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：①化学聚合－催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），通常控制这两种溶液的用量使聚合在1h内完成；②光聚合－催化剂：核黄素，通过控制光照时间和强度可控制聚合时间。
实验二鸡蛋中蛋白质的分离纯化
鸡蛋中卵球蛋白与卵清白蛋白的分离一、实验目的了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作.了解葡聚糖凝胶SephadexG-75分离蛋白质的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术.二、实验原理盐析的原理:蛋白质是亲水胶体,在高浓度的中性盐影响下脱去水化层,同时,蛋白质分子所带的电荷被中和,结果蛋白质胶体的稳定性遭到破坏而沉淀析出。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质的种类及pH有关.分子量大的蛋白质(球蛋白)比分子量小(白蛋白)易析出。
改变盐浓度,使不同分子量的蛋白质分别析出。
分子筛层析。
三、实验用品仪器：752型紫外可见分光光度计、离心机、层析装置器皿：5ml试管20支、50ml烧杯2个、试管架、玻棒、石英比色皿、玻璃层析柱药品及材料：新鲜蛋清、固体硫酸铵、饱和硫酸铵溶液、凝胶SephadexG-75四、实验步骤1、卵球蛋白与卵清蛋白的初步盐析分离取卵清２ml于试管中；加２ml的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀；静置２分钟；4000r/min离心５分钟；沉淀为卵球蛋白,量取取上清液，加入固体硫酸铵（计算3ml溶液饱和度由５０％变化为１００％需要加入硫酸铵的克数1.5g）；8000r/min,离心５分钟；沉淀为卵清白蛋白。
加入2ml蒸馏水溶解卵清白蛋白粗液。
2、凝胶柱层析进一步分离（1）湿装法装柱：老师演示(2) 加样：用加样枪加入1毫升卵清蛋白粗液（3）洗脱:用蒸馏水洗脱(3) 收集与检测:(4) 以洗脱体积为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制洗脱曲线,将蛋白质溶液收集待用.五、实验结果及分析绘制洗脱曲线0612182430364248546000.0110.7670.4680.2430.040.0570.0240.0690.0170.053卵清白蛋白的分离和脱盐-0.200.20.40.60.81020406080体积A -595系列1do。
实验三血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定七年制
五、γ－球蛋白鉴定
用醋酸纤维素薄膜电泳的方法，以 血清电泳图谱为对照，鉴定所分离的蛋 白质种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸 纤维素薄膜电泳）。
DEAE （二乙基氨基乙基）－纤维素含有可离子化的碱 基，可与氢离子结合，γ－球蛋白
血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白的等电点为：
清蛋白pI=4.64，
α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12，
γ球蛋白pI=7.3
进行本洗实脱验。采此用pH0，.01D7E5AEm带o正l/l电p荷H，6.5可N与H带4A负c电缓荷冲的液 α、β-球蛋白和清蛋白结合，而带正电荷的γ-球蛋白 不与DEAE结合，首先从层析柱中洗脱出来，首先收集 到的既是纯化的γ-球蛋白。
脱盐
②上样
γ－球蛋白， 粗提液
③加入洗脱剂
①装柱
葡聚糖凝胶G-25， 柱高18-20cm
④收集
20滴换 一支试管
12
34
流速：每分钟10滴左右 5 6 7 8 9 10
⑤.层析后洗脱液检测
白色比色板,洗净备用。 一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NH4+）,另一
块滴加20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。 不用滴管,避免污染,直接倒… 用“-”表示无现象，用“+”, “++”, “+++”等
吸附层析
凝胶过滤（分子筛）
亲和层析
在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互 配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
【基本原理】
igg分离纯化和鉴定
igg分离纯化和鉴定分离纯化和鉴定是在生物技术领域中常用的实验技术，用于提取目标物质并确定其纯度和特性。
下面以IGG为例，介绍分离纯化和鉴定的步骤和方法。
分离纯化IGG的第一步是蛋白质提取。
可以选择适当的提取缓冲液，将IGG所在的样品（如血浆或细胞培养液）与提取缓冲液进行适当的混合，使细胞或组织中的蛋白质释放出来。
提取后，可以使用离心等方法去除杂质。
将混合物进行离心，使得IGG和其他蛋白质分离。
离心后，可以将上清液取出，其中含有较高纯度的IGG。
为了进一步提高IGG的纯度，可以使用亲和层析等技术。
亲和层析是利用IGG与特定配体之间的亲和力进行分离的方法。
可以将配体固定在柱子上，然后将提取的上清液通过柱子，IGG会与配体结合，其他蛋白质则流过。
最后，通过改变柱子的条件，如改变pH值或添加特定溶剂，可以使IGG与配体解离，从而获得纯净的IGG。
获得纯净的IGG后，需要对其进行鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE和Western blotting。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照分子量分离出来，可以通过与已知分子量的标准蛋白进行比较，确定IGG的分子量。
Western blotting则可以通过与特异性抗体的结合来确认IGG的存在。
除了分子量和存在性，还可以使用其他方法对IGG进行鉴定，如免疫荧光和ELISA等。
免疫荧光可以通过特异性抗体与IGG结合后的荧光信号来检测IGG的存在。
ELISA可以通过与特异性抗体的结合来定量IGG的含量。
总的来说，分离纯化和鉴定IGG是一个复杂的过程，需要使用多种技术和方法。
通过合理的实验设计和操作，可以获得高纯度的IGG，并对其进行准确的鉴定。
这些技术的应用不仅可以用于IGG的分离纯化和鉴定，还可以应用于其他蛋白质的研究和应用中。
蛋白质分离纯化技术实验讲义
蛋⽩质分离纯化技术实验讲义实验⼀蛋⽩质含量分析（Bradford检测法）⼀、实验⽬的1、制作蛋⽩质浓度标准曲线；2、测定未知蛋⽩质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋⽩质的浓度。
⼆、实验原理Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋⽩质浓度是1976年由Bradford建⽴的，是最常⽤的蛋⽩质快速定量⽅法。
该⽅法根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红⾊，最⼤光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋⽩质结合后变为青⾊，蛋⽩质-染料结合物在595nm波长下有最⼤光吸收，且光吸收值与蛋⽩质含量成正⽐，因此可⽤于蛋⽩质含量的定量测定。
蛋⽩质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应⼗分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。
Bradford法的突出优点是：灵敏度⾼；测定快速、简便，只需加⼀种试剂；⼲扰物质少。
此法的缺点是：仍有⼀些物质⼲扰此法的测定，主要的⼲扰物有去污剂、Triton X-100、SDS 和0.1N的NaOH。
三、试剂与器材1、试剂：1mg/ml ⽜⾎清蛋⽩（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；⽆⽔⼄醇；85%磷酸；MiliQ⽔。
2、器材：滤纸；烧杯；漏⽃；可见分光光度计；试管。
四、实验⽅法1、考马斯亮蓝G-250染料的配置称100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于47.5 ml ⽆⽔⼄醇后，再加⼊100 ml 85%的磷酸，加MiliQ⽔定容⾄1 L，过滤备⽤。
2、标准蛋⽩溶液的稀释取10⽀试管，按表中顺序排列，分别加⼊考马斯亮蓝溶液、⽔和样品。
每加完⼀管，⽴即振荡混匀（注意不要太剧烈，以免产⽣⼤量⽓泡⽽难于消除）。
未知样品的编号为8、9、10号管。
3、加完试剂2-5min后，即可⽤⽐⾊⽫，在分光光度计上测定各样品在595nm处的吸光值OD595。
注意：不可使⽤⽯英⽐⾊⽫（因不易洗去染⾊），可⽤塑料或玻璃⽐⾊⽫，使⽤后⽴即⽤少量95%的⼄醇冲洗，塑料⽐⾊⽫不可⽤⼄醇或丙酮长时间浸泡。
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蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。
二、实验过程：1.蛋白质粗提液制备溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液（1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L；（2）250mL2.蛋白质浓度测定（1）溶液配制1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。
（2）0~100ug/mL标准曲线测定：取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL蛋白质浓度0 20 40 60 80 100µg/ml1mg/mL BSA溶0 40 80 120 160 200液（µl）蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。
以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。
（3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。
3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离（1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。
（2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。
（3）平衡：用10倍于柱床体积的0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液洗柱，是柱中的离子环境和样品中的一致。
（4）上样：柱床表面液体正好达到凝胶表面，关闭活塞，将蛋白粗提液（留过20uL供电泳用）缓慢加到凝胶表面，注意不能把凝胶冲起来（5）收集：打开活塞，使样品流下，样品完全进入凝胶后，缓慢加入0.1mol/L pH7.4的磷酸缓冲液（注意不能把凝胶冲起来）使样品继续流出，分部收集流出物，第一管收集1mL，以后每管收集200uL，共收集6管。
（6）稀释20倍，测定每个组分的蛋白浓度，可只测定一个OD595值，计算各组分的蛋白浓度。
4.SDS—PAGE溶液配制：100ml 30%凝胶储液（arc/bis）：29.2g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于80ml 蒸馏水中，定容至100ml，避光保存。
（该溶液有神经毒性，避免接触皮肤）；100mL 1.5M Tris-HCl 三（羟甲基）氨基甲烷，pH8.8：18.15gTris 碱溶于60mL 蒸馏水中，用HCl调pH至8.8，定容至100ml蒸馏水中；100ml 0.5M Tris-HCl（缓冲液）,pH6.8：6gTris 碱溶于60ml蒸馏水中，用HCl 调pH值至6.8，定容至100ml蒸馏水中；10ml上样缓冲液：0.5ml ddH2O（重蒸水，经过两次蒸馏的水）+ 2.5ml of 0.5M Tris-HCl, pH6.8 + 2ml 甘油+ 4ml 10% SDS（十二烷基硫酸钠）+77.1mg DTT （二硫苏糖醇）+1ml 0.05（W/V）溴酚蓝；600ml 5×电泳缓冲液（？）：9g Tris碱+43.2g甘氨酸+3gSDS，蒸馏水溶解定容至600ml；1ml 10%过硫酸铵溶液（现用现配）：0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中。
1000ml固定液：取908ml 50%的甲醇和92ml冰乙酸混匀；500ml染色液：0.25g考马斯亮蓝R（G?）250，加500ml固定液溶解，过滤后避光保存；1000ml脱色液：取75ml冰乙酸和50ml甲醇，加蒸馏水定容至1000ml。
凝胶制备7.5%分离胶（20ml）10%SDS 0.2mlddH2O 11.87ml10%的AP（过硫酸铵溶液）0.1mlTEMED（.四甲基乙二胺）10µl30% arc/bis 5ml1.5M pH8.8 Tris-HCl2.5ml4%浓缩胶（10ml）ddH2O 6ml30% arc/bis 1.3ml0.5MpH6.8Tris-HCl 2.5ml10%SDS 0.1ml10%的AP 0.05mlTEMED 5µl灌胶：将电泳板组装好，先灌分离胶至2/3处，水封，分离胶凝固后，吸去水，灌入浓缩胶至满，插入梳子，注意不要产生气泡，待胶凝固后，拔去梳子。
样品准备：分子量Marker、100µg粗提液、100µg分离组分与样品缓冲液混合（哪种，混合比例），煮沸3min，作为电泳样品上样。
电泳装置安装：安好后在正负极分别加入稀释好的电极缓冲液。
上样：将处理好的样品分别加入样品孔中，记好加样顺序。
电泳：接好电泳仪，通电，先恒压80V电泳，溴酚蓝前沿到达分离胶界面时，加大电压至120V继续电泳，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部，结束电泳。
剥胶：拆开电泳装置，取出玻璃板，看清点样方向，从玻璃板的一角撬起，凝胶留在长板上，在右下角切角作标记，用固定液冲下凝胶。
固定：将凝胶放在大培养皿中，用固定液固定1h；染色：倒去固定液，加入染色液，染色1h，脱色：倒去染色液，加入脱色液进行脱色，直至看清条带。
凝胶拍照。
三、实验结果1、各组分蛋白浓度2、电泳结果四、分析讨论分离效果如何？实验设计如何改进？总黄酮生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。
在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。
简介近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。
类黄酮参与了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。
它们对健康的好处有：（ 1 ）抗炎症（ 2 ）抗过敏（ 3 ）抑制细菌（ 4 ）抑制寄生虫（ 5 ）抑制病毒（ 6 ）防治肝病（7 ）防治血管疾病（8 ）防治血管栓塞（9 ）防治心与脑血管疾病（10 ）抗肿瘤（11 ）抗化学毒物等。
天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂肪氧化、抗衰老。
近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。
目前，很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。
例如，茶叶提取物和银杏提取物。
葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。
从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮" 碧萝藏"-- （英文称PYCNOGENOL ）在欧洲以不同的商品名实际行销应用25 年之久，并被美国FDA 认可为食用黄酮类营养保健品，所报告的保健作用相当广泛，内用称之为" 类维生素" 或抗自由基营养素，外用称之为" 皮肤维生素" 。
进一步的研究发现碧萝藏的抗氧化作用比VE 强50 倍，比VC 强20 倍，而且能通过血脑屏障到达脑部，防治中枢神经系统的疾病，尤其对皮肤的保健、年轻化及血管的健康抗炎作用特别显著。
在欧洲碧萝藏已作为保健药物，在美国作为膳食补充品（相当于我国的保健食品），风行一时。
随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入，不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。
性状：片剂。
功能主治与用法用量功能主治：本品具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用，可用于缓解高血压症状（颈项强痛）、治疗心绞痛及突发性耳聋，有一定疗效。
用法及用量：口服：每片含总黄酮６０ｍｇ，每次５片，１日３次。
不良反应与注意不良反应和注意：目前,暂没有发现任何不良反应.洛伐他丁【中文名称】：洛伐他丁【英文名称】：Lovastatin【化学名称】：(S)-2-甲基丁酸-(1S,3S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基-8-[2-(2R,4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基]-乙基]-1-萘酯【化学结构式】：洛伐他丁结构式【作用与用途】洛伐他丁胃肠吸收后，很快水解成开环羟酸，为催化胆固醇合成的早期限速酶（HMG －coA还原酶）的竞争性抑制剂。
可降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的胆固醇含量。
亦可中度增加高密度脂蛋白胆固醇和降低血浆甘油三酯。
可有效降低无并发症及良好控制的糖尿病人的高胆固醇血症，包括了胰岛素依赖性及非胰岛素依赖性糖尿病。
【用法用量】口服：一般始服剂量为每日20mg，晚餐时1次顿服，轻度至中度高胆固醇血症的病人，可以从10mg开始服用。
最大量可至每日80mg。
【注意事项】①病人既往有肝脏病史者应慎用本药，活动性肝脏病者禁用。
②副反应多为短暂性的：胃肠胀气、腹泻、便秘、恶心、消化不良、头痛、肌肉疼痛、皮疹、失眠等。
③洛伐他丁与香豆素抗凝剂同时使用时，部分病人凝血酶原时间延长。
使用抗凝剂的病人，洛伐他丁治疗前后均应检查凝血酶原时间，并按使用香豆素抗凝剂时推荐的间期监测。
他汀类药物他汀类药物(statins)是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。