啤酒酵母选育

啤酒酵母选育

紫外诱变及其突变株的性能测试

1材料与方法

1.1材料

菌种：四铃啤酒酵母

仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。

培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）

1.2试验方法

1.2.1酵母菌的活化

取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养14h，得到正常生长时期的酿酒酵母菌悬液。

然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采纳28℃恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。

1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定

1.2.2.1菌悬液的制备

取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。

取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养终止用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，按照所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。

（此图视为参考）

1.2.3紫外线诱变试验

用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。(此处菌悬液浓度的确定采纳三种方法：1.显微镜直截了当计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)

备注：平板直截了当计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流淌，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，然而也是我们的强项，能够锤炼大一的动手能力。

2：显微镜直截了当计数法：比较直观，我们能够直截了当显微观看，多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，同时我系其他实验组采纳此方法计数，可供参考。

3：光电比浊法：尽管绘制标准曲线要求较高，然而工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后能够用，准确率较高。

比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，能够校正方案。

实验步骤：

打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳固。

1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，28℃活化培养14h。

2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL 生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直截了当计数，调整细胞浓度。

3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对比。

4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。

5 30W紫外灯下30cm处照耀，调整照耀时刻。

此次预设为0，30，45，60，90，120，180，600.（单位s）

6取一定稀释梯度的紫外照耀菌液0.1（视具体情形而定）用无菌涂布棒涂布平均，每组做三个平行线培养记录菌落数，运算各照耀时刻下的致死率。（选在75%-80%）。

致死率=未经照耀菌落数-紫外照耀菌落数

未经紫外照耀菌落数

7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，

28℃培养20h左右，运算其突变率和致死率。（上述时刻等数字视为参考数值）

1.2.3.1初筛

诱变后选择在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。

1.2.3.2复筛

供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。

双乙酰含量测定：

初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml 120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4 株菌分不编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4 。结果见表1

表1 发酵液中双乙酰含量的比较

菌株 F B FB-E1 FB-E2 FB-E3 FB-E4

双乙酰含量(mg/L) 0.1233 0.0706 0.0926 0.0776 0.0870

降低率(%) 0 42.7 24.9 37.1 29.4

（此处绘制表格样式视为参考）

降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量

措施：改良酵母菌种

提升麦汁中α-氨基氮含量，能够抑制合成酶的活性

2加速双乙酰的还原

措施：提升酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）

提升还原温度（封罐后高温还原）

限制后期酵母的出芽率（封罐）

国标中关于啤酒中双乙酰的量的要求

二级啤酒：0.2mg/L 一级啤酒：0.13mg/L

方法：国标GB4927-2001检测

培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。

原理：双乙酰的测定方法采纳比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，因此，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。但此法快速简便。用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸取峰，可进行定量测定。

1仪器：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶（2000mL或3000 mL）或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL

2试剂和溶液

盐酸溶液（4moL/L），邻苯二铵溶液：10g/L（称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配）消泡剂

3实验步骤

(1)把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。

(2)将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。

(3)加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。

(4)于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒10 0mL。

(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。

(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。