第12章 植物遗传转化
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其中，章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒较为常见。
2、Ti质粒的基因位点及其功能区域
LB RB
❖ Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右） （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）: T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并
整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。 （2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒
来源不同可分成有4类： ①细菌质粒（plasmid）：大肠杆菌质粒，农杆菌质粒 ②噬菌体类：包括λ噬菌体衍生物、M13噬菌体、柯斯质粒 ③酵母的质粒： ④病毒DNA的衍生物等。
按功能及构建过程，又可把有关载体分为四大类型
植物基因 工程载体
克隆载体
中间载体
中间克隆载体
中间表达载体
•onc卸甲载体
•Onc+
•一元转化载体（共整合载体和拼接末端载体） 转化载体 •双元转化载体
❖ 克隆载体：用于保存和克隆目的基因。 ❖ 中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体，前者是由大肠杆
菌质粒插入了T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是 构建中间表达载体的基础质粒。后者是含有植物特异启动子的中 间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。
因此，常常需要利用特定的运载工具，把外源DNA片段送入受 体细胞，我们把携带外源基因进入受体细胞的这种运载工具叫做载 体（vector）。
载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连和导入受体细 胞，还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中得到复制或 表达。
一、植物基因工程载体种类
三、Ti质粒介导基因转化的原理
❖ 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α-羟基乙酰丁香酮等)。 ❖ 2. 酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位
后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIR A蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。 ❖ 3. T-DNA单链分子释放： virD 基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB) 切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链 形式释放出来。 ❖ 4. T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIR D2蛋白共价结合， 并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及 植物的细胞壁、细胞膜和核膜。
植物遗传转化是植物基因工程的主要内容。通过基因转移技术 可以把不同来源的基因包括来自异种植物、动物和微生物的基因导 入植物细胞，这种大范围的基因交流为创造有价值的植物新种质材 料，并培育新品种奠定了基础。
第一节 植物基因工程载体及其构建
植物遗传转化的核心问题是将外源基因导入细胞，并使它得到 表达。一般情况下，一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，或 即使进入细胞，也很难进行复制和功能表达。
二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfaciens）：
携带有Ti质粒（Tumor-inducing plasmid） 农杆菌属（Agrobacterium）
有2种重要植物病原菌
发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenesis）：
携带有Ri 质粒(Root -inducing plasmid)
❖ 卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作 为构建转化载体的受体质粒。
❖ 转化载体：是用于目的基因导入细胞的载体，亦称工程载体。它 是由中间表达载体和卸甲载体构建而成的，根据它的结构特点又 可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。
在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌质粒，农杆菌质粒) 和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重 点介绍的内容。
性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共24个基因。 （3）Con区（regions encoding conjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控
Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。
Ti质粒上有一段DNA，称为T-DNA(Transferred DNA)，它能转移并整 合进植物基因组中，导致植物产生冠瘿瘤(crown gall Tumor)并合成冠 瘿碱(opine),为其生长发育和繁殖提供碳源、氮源和能量，干扰被侵染 植物的正常生长。
根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。
根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfaciens）
迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它 们的Ti质粒结构特性均有差别。
根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可 被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、 农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱 型(succinamopine)。
alfaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱfa
冠瘿瘤病(根癌病)症状 1、植物根及茎基部产生 2、最初原因是受伤后引起
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)
1、Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA 分子，其分子量为9.5×107～1.6×108，大小为180～250kb。
第十二章 植物遗传转化
1、植物基因工程载体及其构建 2、植物遗传转化方法和技术 3、转化体的筛选与检测
植物遗传转化(plant genetic transformation)是指通过某种 途径将外源基因导入受体植物基因组中，并使之在受体植物细胞内 实现功能表达。这个被导入的外源基因称为转基因(transgene)， 所得到的植株称为转基因植物(transgenic plant)。
2、Ti质粒的基因位点及其功能区域
LB RB
❖ Ti质粒结构示意图（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图（右） （1）T-DNA区（transferred-DNA regions）: T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上脱离下来转移并
整合到植物的核基因组上的一段DNA。T-DNA片段上的基因与肿瘤形成有关。 （2）Vir区（virulence region）:该区段上的基因的产物为T-DNA的转移及整合所必需，它导致农杆菌产生毒
来源不同可分成有4类： ①细菌质粒（plasmid）：大肠杆菌质粒，农杆菌质粒 ②噬菌体类：包括λ噬菌体衍生物、M13噬菌体、柯斯质粒 ③酵母的质粒： ④病毒DNA的衍生物等。
按功能及构建过程，又可把有关载体分为四大类型
植物基因 工程载体
克隆载体
中间载体
中间克隆载体
中间表达载体
•onc卸甲载体
•Onc+
•一元转化载体（共整合载体和拼接末端载体） 转化载体 •双元转化载体
❖ 克隆载体：用于保存和克隆目的基因。 ❖ 中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体，前者是由大肠杆
菌质粒插入了T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是 构建中间表达载体的基础质粒。后者是含有植物特异启动子的中 间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。
因此，常常需要利用特定的运载工具，把外源DNA片段送入受 体细胞，我们把携带外源基因进入受体细胞的这种运载工具叫做载 体（vector）。
载体的本质是DNA。 经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连和导入受体细 胞，还能利用本身的调控系统使外源基因在新的细胞中得到复制或 表达。
一、植物基因工程载体种类
三、Ti质粒介导基因转化的原理
❖ 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质(如乙酰丁香酮、α-羟基乙酰丁香酮等)。 ❖ 2. 酚类物质诱导Ti质粒上毒性基因(vir)表达:当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位
后，这些酚类小分子化合物诱导信号经VIR A蛋白传递给VIR G， VIR G激活其它vir 基因( virB、 virC、 vir D、virE )表达Ti质粒上毒性基因(vir)表达。 ❖ 3. T-DNA单链分子释放： virD 基因编码一种核酸内切酶，先在T-DNA右边缘区(RB) 切开一个单链缺口，再在同一链左边缘区(LB)切开另一个单链缺口，使T-DNA以单链 形式释放出来。 ❖ 4. T-DNA单链分子转移到寄主细胞：T-DNA单链分子与vir产物VIR D2蛋白共价结合， 并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及 植物的细胞壁、细胞膜和核膜。
植物遗传转化是植物基因工程的主要内容。通过基因转移技术 可以把不同来源的基因包括来自异种植物、动物和微生物的基因导 入植物细胞，这种大范围的基因交流为创造有价值的植物新种质材 料，并培育新品种奠定了基础。
第一节 植物基因工程载体及其构建
植物遗传转化的核心问题是将外源基因导入细胞，并使它得到 表达。一般情况下，一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，或 即使进入细胞，也很难进行复制和功能表达。
二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能
根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfaciens）：
携带有Ti质粒（Tumor-inducing plasmid） 农杆菌属（Agrobacterium）
有2种重要植物病原菌
发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenesis）：
携带有Ri 质粒(Root -inducing plasmid)
❖ 卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作 为构建转化载体的受体质粒。
❖ 转化载体：是用于目的基因导入细胞的载体，亦称工程载体。它 是由中间表达载体和卸甲载体构建而成的，根据它的结构特点又 可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。
在植物基因转化的研究中，主要使用细菌质粒(大肠杆菌质粒，农杆菌质粒) 和植物病毒作为载体。其中以根癌农杆菌Ti质粒转化载体是最为重要，是本章重 点介绍的内容。
性，故称之为毒区。在Vir区有VirA、 VirB、 VirC、 Vir D、VirE、 VirG、 VirH7个操纵子共24个基因。 （3）Con区（regions encoding conjugations）:该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（tra）,调控
Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，故称为结合转移编码区。 （4）Ori区（origin of replication）:该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区（点）。
Ti质粒上有一段DNA，称为T-DNA(Transferred DNA)，它能转移并整 合进植物基因组中，导致植物产生冠瘿瘤(crown gall Tumor)并合成冠 瘿碱(opine),为其生长发育和繁殖提供碳源、氮源和能量，干扰被侵染 植物的正常生长。
根癌农杆菌一般只侵染双子叶植物。
根癌农杆菌（Agrobacterium tumerfaciens）
迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌，它 们的Ti质粒结构特性均有差别。
根据Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine)种类不同，Ti质粒可 被分为四种类型：章鱼碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、 农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱 型(succinamopine)。
alfaቤተ መጻሕፍቲ ባይዱfa
冠瘿瘤病(根癌病)症状 1、植物根及茎基部产生 2、最初原因是受伤后引起
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)
1、Ti质粒的遗传特性及类型
Ti质粒为染色体外遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA 分子，其分子量为9.5×107～1.6×108，大小为180～250kb。
第十二章 植物遗传转化
1、植物基因工程载体及其构建 2、植物遗传转化方法和技术 3、转化体的筛选与检测
植物遗传转化(plant genetic transformation)是指通过某种 途径将外源基因导入受体植物基因组中，并使之在受体植物细胞内 实现功能表达。这个被导入的外源基因称为转基因(transgene)， 所得到的植株称为转基因植物(transgenic plant)。