焦磷酸测序技术在4种食源性致病菌快速检测中的应用
焦磷酸测序技术的原理及应用
ＳＯＩ ＯＥ ＆ ＴＥ ＥＮ ＣＨＮＯＬＯＯＹ ＮＦＯＲＭＡＴＩ Ｉ ＯＮ 术的原理及应用
葛剑徽
（ 东南大学生物科学和医学工程系 ２０９ ） １０６ 摘 要：焦磷酸测序技术是由４ 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应 ，适于对已知的短序列的测序分析，其可重复 性和精确性能 与 Ｓ ｎ ｅ Ｎ ａ ｇｒＤ Ａ测序法相媲美 ，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技 术不需要凝胶 电泳 ，也不需要对 Ｄ Ａ样品进行 Ｎ 任何特殊形式的标记和染色，具备同时对大量样品进行测序分析的能力。在单核苷酸多态性、病原微生物快速鉴定、病因学和法医
—
长 度很短 （０—３ ｂ ２ ０ ｐ）的主要原因之一 。而 Ｇ ａ ｉａ ｅ ｈ ｒ ｄ ｈ等人对 ｚ 此进行了变革１， ７ 他们在反应体系中只加人 Ｓ — ＡＴ Ｉ ｐ ｄ Ｐ一 ０ 一Ｓ 【 ， 而 不加入无用的 Ｒｐ ｄ Ｔ — — ，提高了反应的效率 。 —ＡＰ Ｓ 大大降 低了ｄ Ｔ 一０一 降解产物的浓度 ， Ａ Ｐ 【Ｓ 使得 Ａ ｙａｅ ｐ ｒｓ酒性 能够维持
鉴定研究等方面有着越来越广泛 的应用。 美键词 ： 焦磷酸测序技术 单核苷酸 多态性 中圈分类号 ： Ｑｌ１ Ｔ ｌ 文献标识码 ： Ａ ＡＴ － 焦磷酸测 序技 术（ｙ ｏ ｑｅｃ ｇ是 由Ｎ ｒ 等人于 ｔ８年 有效地利用 ，也 能更有利于 阅读富含 Ｔ地区域。但 ｄ Ｐ ｑ— ｐ ｒｓ ｕｎｉ ） ｅ ｎ ｙｅ ｎ ７ ９ 发展起来的一种新 型的 酶联级联测序技 术［ 】 】 ，焦磷酸 测序法适 Ｓ是两种异构体 Ｓ － ＡＴ — — ｐ ｄ Ｐ Ｓ和 Ｒｐ Ａ — — －ｄ ＴＰ Ｓ的混合 ｐ ＡＴＰ — — Ｓ。为 了得到最佳反应效 于对 已知的短序列的测序分析 ， 其可重复性和精确性能与Ｓ ｎ ｅ 物 ，聚 合酶 只能利用 Ｓ －ｄ ａ ｇｒ Ｄ ＮＡ测序法相媲美 ，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产 品具备同时对大量样 品进行测序分析的 能力 ，为大通量 、低成 本 、适时 、快速 、直观地进行单核苷酸多态性 （ｉｇｅ ｎ ｃｅ ｓｎ ｌ ｕ ｌ— ｏｉｅ ｐ ｔｍｏｐ ｉ ，Ｓ ｓ 研究和临床检验提供 了非常理想 ｔ ｏｙ ｒ ｈｓ ｄ ｍｓ ＮＰ ） 的技术操 作平台 。 该技术进行改进后可 以满足上百个核苷酸序列 的测序工作 ， 这样该技术 又可 以满 足对重要微生物的 鉴定与分 型 ．特定 ＤＮＡ片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。 率 ，必需在 反应 体系中保持最佳浓度的 Ｓ － ＡＴ － ｐ ｄ Ｐ— Ｓ，与 此 同时 相应的 Ｒｐ ｄ Ｐ～ Ｃ — － ＡＴ ｔ Ｓ的浓度也在增加。而 ｄ ＡＴＰ － Ｓ Ａ ｙａｅ 被 ｐ ｒｓ降解后的产物是 Ａ ｙ ａｅ ｐ ｒｓ 的抑制剂 ， 随着反应 的进行 ，Ａｐ ｒ ｓ 的活性会越来越低 ，这是焦磷酸测序技术测序 ｙ ａｅ
PCR-焦磷酸测序技术检测奶牛乳房炎4种主要致病菌方法的建立
PCR-焦磷酸测序技术检测奶牛乳房炎4种主要致病菌方法的建立剧慧栋;李月颖;张乐祎;李秀娟;赵宝华;徐保红【摘要】Via PCR-pyrosequencing technology, a new rapid method to detect and identify Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae, Salmonella sp. and Slaphylococcus aureus, 4 major cow mastitis pathogens was established. According to the conserved sequences retrieved from CenBank of sip of Streptococcus agalactiae, Up of S. dysgalactiae, sin of Salmonella sp. and clfa of Staphylococcus aureus, two amplification primers and one sequencing primer were designed for each gene accordingly. Using all the above pairs of amplification primers in turn, target gene fragments were amplified by PCR from 108 S. agalactiae strains, 100 5. dysgalactiae strains, 136 SaL sp. strains, 203 St. aureus strains and several other reference strains. Then, sequence the conserved regions of the positive PCR products by pyrosequencing technology. Finally, the PCR and pyrosequencing results of all the target strains and reference strains were as expected, and the repeatability was credible. PCR-pyrosequencing technology was applicable to detect and identify the above-mentioned 4 major bovine mastitis pathogens. The method had good points of accuracy and rapidity.%应用PCR-焦磷酸测序技术(pyrosequencing)一种新型快速检测奶牛乳房炎(bovine mastitis)4种主要致病菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、沙门氏菌(Salmonella sp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法.根据GenBank中无乳链球菌的sip基因、停乳链球菌的isp基因、沙门氏菌的stn基因和金黄色葡萄球菌的clfa基因的序列信息,分别设计各基因保守区段的PCR扩增引物及焦磷酸测序引物.分别以108株无乳链球菌、100株停乳链球菌、136株沙门氏菌、203株金黄色葡萄球菌,以及多株其他参照菌为模板,轮流使用上述各扩增引物进行PCR扩增目的基因片段.随后采用焦磷酸测序技术针对阳性PCR扩增片段进行核苷酸保守区段的测序分析.最终得到预期的PCR扩增和焦磷酸测序结果,且实验结果具有可靠的重复性.PCR-焦磷酸测序技术适用于上述奶牛乳房炎4种主要致病菌的检测鉴定,具有准确、快速等优点.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2012(032)006【总页数】7页(P58-64)【关键词】PCR-焦磷酸测序;奶牛乳房炎;无乳链球菌;停乳链球菌;沙门氏菌;金黄色葡萄球菌【作者】剧慧栋;李月颖;张乐祎;李秀娟;赵宝华;徐保红【作者单位】石家庄市疾病预防控制中心,河北石家庄050011;河北师范大学,河北石家庄050024;河北师范大学,河北石家庄050024;石家庄市疾病预防控制中心,河北石家庄050011;河北师范大学,河北石家庄050024;石家庄市疾病预防控制中心,河北石家庄050011【正文语种】中文【中图分类】S852.6奶牛乳房炎是奶牛的一种多发病和常见病，是由多种致病微生物引起的局部病变，对奶牛养殖业造成了巨大损失。
食品安全快速检测技术在食源性致病菌检测中的应用
食品安全快速检测技术在食源性致病菌检测中的应用作者：胡婵娟胡莉吴志豪戚俊峰来源：《食品安全导刊·下》2024年第05期摘要：本文针对食源性致病菌检测的迫切需求，深入分析了主要致病菌的特性，并探讨了食品安全快速检测技术的多种方法及其面临的挑战。
文章重点介绍了核酸扩增、免疫分析、生物传感等技术的优势与局限，同时针对样品基质复杂性、低丰度致病菌的富集分離以及现场快速检测设备的稳定性问题，提出了具体的技术改进对策。
通过优化检测技术，可显著提升食源性致病菌检测的灵敏度、特异性和操作便捷性，为食品安全监管提供强有力的技术支撑。
关键词：食源性致病菌；快速检测；核酸扩增The Application of Fast Food Safety Detection Technology in the Detection of Foodborne PathogensHU Chanjuan1， HU Li1， WU Zhihao1， QI Junfeng1，2*（1.School of Biological and Food Engineering， Huanghuai University， Zhumadian 463000， China; 2.Department of General Medicine， Affiliated Zhumadian Central Hospital of Huanghuai University， Zhumadian 463000， China）Abstract： This article focuses on the urgent need for the detection of foodborne pathogens，analyzes in depth the characteristics of the main pathogens， and explores various methods and challenges of rapid food safety detection technology. The article focuses on the advantages and limitations of technologies such as nucleic acid amplification， immunoassay， and biosensing. At the same time， specific technical improvement measures are proposed to address the complexity of sample matrices， the enrichment and separation of low abundance pathogenic bacteria， and the stability of on-site rapid detection equipment. By optimizing detection techniques， the sensitivity，specificity， and operational convenience of detecting foodborne pathogens can be significantly improved， providing strong technical support for food safety supervision.Keywords： foodborne pathogens; rapid detection; nucleic acid amplification食源性疾病是由污染的食物或水引起的疾病，已成为全球公共卫生的重大问题。
焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分GlymBd 30K基因
焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分GlymBd 30K基因金莹;房保海;刘新亮;孙涛;贾俊涛;赵丽青;孙雯娴【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)003【摘要】[目的]建立一种通过焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的方法.[方法]针对大豆GlymBd30K基因设计特异性PCR引物和焦磷酸测序引物,利用设计的特异性引物扩增各测试材料的特异基因片段并进行焦磷酸测序.[结果]该检测方法对大豆过敏原成分具有非常好的重现性和特异性,测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,表明目标序列能够作为鉴定GlymBd 30K基因很好的序列.[结论]为食品中的大豆过敏原成分快速检测提供很好的技术支撑.【总页数】4页(P29-31,49)【作者】金莹;房保海;刘新亮;孙涛;贾俊涛;赵丽青;孙雯娴【作者单位】黄岛出入境检验检疫局,山东青岛266555;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;黑龙江出入境检验检疫局,黑龙江哈尔滨150001;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.应用焦磷酸测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因型 [J], 徐琴;黄盛文;杨楠楠;王仕敏;罗振元;安邦权2.基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法 [J], 解美霞;王永;王燕;赵新;高越;刘双;陈锐;兰青阔;徐晓辉;曹际娟3.大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的抗原表位区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定 [J], 林苏霞;王晓梅;刘志刚;曾梦雅;吴研;陈家杰4.大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因的克隆及其原核表达载体的构建 [J], 邬玉兰;刘志刚5.焦磷酸测序技术检测k-ras基因突变方法的建立 [J], 周霞辉;吴成就;肖乐东;孙立贤;曹忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌
利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌杨会勇;那广水;朱术会;邹秉杰;奚涛;周国华【期刊名称】《中国药科大学学报》【年(卷),期】2009()5【摘要】目的:建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。
方法:首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。
结果:成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2μL 的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。
测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。
通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌:副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。
结论:本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。
【总页数】5页(P460-464)【关键词】海洋弧菌;LATE-PCR;焦磷酸测序;16S;rRNA基因;外膜蛋白K基因【作者】杨会勇;那广水;朱术会;邹秉杰;奚涛;周国华【作者单位】中国药科大学生命科学与技术学院;华东医学生物技术研究所;国家海洋环境监测中心海域生态环境重点实验室;南京大学医学院【正文语种】中文【中图分类】S941【相关文献】1.PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究 [J], 孟成艳;金嘉琳;雷建强;王莹;张舒;张文宏2.焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究 [J], 张丽娜;郑妍;胡成进;周月霞;陈英剑3.PCR-焦磷酸测序检测副溶血性弧菌研究 [J], 许龙岩;袁慕云;唐勤;阳静;邹志飞;相大鹏4.应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒 [J], 王彩霞;杨贝娜;赵昱林;张永宁;吕继洲;冯春燕;袁向芬;邓俊花;吴绍强5.PCR-焦磷酸测序技术在HPV型别检测中的应用 [J], 陈秀杰;段蒙;班蕊;周莉美;曲芃芃因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR-焦磷酸测序法快速鉴定食品中肠炎沙门菌
PCR-焦磷酸测序法快速鉴定食品中肠炎沙门菌曹冬梅;倪长鹏;刘宇;卢熠川;许龙岩;曹际娟【摘要】通过对肠炎沙门菌特异性基因片段的焦磷酸测序,达到快速鉴定肠炎沙门菌的目的.设计PCR扩增引物和焦磷酸测序引物,对PCR扩增产物进行焦磷酸测序,测得序列进行BLAST比对分析.通过对肠炎沙门菌特异性基因上的30个碱基片段进行测定,可准确鉴定16株肠炎沙门菌.所建立的方法可以从基因序列水平上准确鉴定肠炎沙门菌,具有快速、准确的优势.【期刊名称】《大连工业大学学报》【年(卷),期】2015(034)001【总页数】5页(P29-33)【关键词】肠炎沙门菌;PCR-焦磷酸测序;鉴定【作者】曹冬梅;倪长鹏;刘宇;卢熠川;许龙岩;曹际娟【作者单位】辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连 116001;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连 116001;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连 116001;大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034;广东出入境检验检疫局,广东广州 510623;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连 116001【正文语种】中文【中图分类】TS207.4沙门菌属菌型甚多，目前在全世界范围内已发现2 500余种血清型，我国也有292种被检出的报道［1］。
肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis，SE）是肠道沙门菌的一种主要血清型，由于其致病性强、感染对象广泛等特点，引起了各国学者的广泛关注［2－5］。
1996年，我国向欧洲出口的兔肉中检测出了肠炎沙氏菌，直接导致损失3 000多万元［2］。
2010年，美国加利福尼亚州肠炎沙门菌疫情肆虐，染病人数多达数百人，引发疫情的“问题蛋”召回数量达到5亿枚，造成了严重的经济损失。
目前，肠炎沙门菌最主要检测手段仍是生化鉴定配合血清分型，但检测周期过长，不利于疾控预防与病情诊断。
荣策等［6］建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙氏菌的方法。
田会方等［7］采用PCR－焦磷酸测序技术在沙门菌食物中毒中进行了应用检测，但不能鉴定血清型。
甲基化检测之金标准焦磷酸测序技术
甲基化检测之⾦标准焦磷酸测序技术中科普瑞作为中国⼗万⼈甲基化组计划的执⾏⽅，对甲基化检测的相关技术进⾏了优化升级，建⽴了专业的甲基化检测⼀站式服务平台。
今天⼩编为⼤家介绍甲基化检测的⾦标准—焦磷酸测序技术，后⾯陆续介绍其他甲基化检测技术，敬请期待哦！焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，已成为甲基化检测的⾦标准。
焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的同⼀反应体系中的酶级联化学发光反应。
具体过程如下：步骤1：扩增DNA⽚段并对焦磷酸模板链进⾏⽣物素化。
通过变性，分离⽣物素化的单链PCR 扩增⼦并使其与⼀条测序引物进⾏杂交。
步骤2：将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。
步骤3：第⼀个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引⼊反应。
DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进⾏延伸。
每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。
步骤4：ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。
⽣成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并⽣成与ATP的数量成⽐例的可见光。
电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所⽣成的光，并将其作为原始输出数据中的⼀个峰值（热解图Pyrogram）。
每个峰值（光信号）的⾼度与核苷酸结合的数⽬呈⽐例关系。
步骤5：腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进⾏分解。
当分解完成时，便会引⼊另⼀个核苷酸。
步骤6：dNTP的添加反应在持续进⾏着。
应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利⽤，却并不会被荧光素酶所识别。
焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌四种药物耐药性
世界中医药2015年11月第10卷·779·对照组给予生理盐水灌胃。
在第4周末最后一次灌胃后禁食不禁水。
10%乌拉坦麻醉后腹主动脉取血，在室温下静置4小时后使用4000转/分钟离心10分钟，分离血清进行MDA含量及SOD和GSH-Px的检测，取脑组织和肝组织进行匀浆，分离上清进行MDA含量及SOD和GSH-Px的检测。
1.5统计学分析 实验数据以（sx±）表示，使用SPSS17.0软件进行统计学分析，组间比较用单因素方差分析。
2 结果2.1对老年大鼠血清MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影响老年大鼠血清的MDA含量与青年组相比明显升高，且SOD和GSH-Px 活性明显下降；4周灌胃治疗后，治疗组与老年对照组相比，大鼠血清中的MDA含量明显降低，且SOD和GSH-Px活性明显增强（P＜0.05），见表1。
表1红景天提取物对老年大鼠血清MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影响组别 n MDA（nmol/nm）SOD（nmol/nm）GSH-Px(U/mg) 青年对照组 12 9.21±2.11*38.63±4.78*205.73±27.86*老年对照组 12 17.42±3.79 21.54±5.27 152.76±18.77 红景天高剂量组 12 10.03±2.13*36.78±4.92*193.79±23.57*红景天低剂量组 12 12.78±2.51*Δ 34.54±5.12*Δ 187.83±23.95*Δ注：*与老年对照组相比，P＜0.05；Δ与青年对照组相比，P＜0.052.2对老年大鼠脑组织MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影响老年大鼠脑组织的MDA含量与青年组相比明显升高，且SOD和GSH-Px活性明显下降；经过4周红景天灌胃治疗后，治疗组大鼠脑组织中的MDA含量明显降低，且SOD和GSH-Px活性明显增强，与老年对照组相比具有显著意义（P＜0.05），见表2。
焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分GlymBd 30K基因
焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分GlymBd 30K基因金莹;房保海;刘新亮;孙涛;贾俊涛;赵丽青;孙雯娴【摘要】[目的]建立一种通过焦磷酸测序技术检测大豆过敏原成分的方法.[方法]针对大豆GlymBd30K基因设计特异性PCR引物和焦磷酸测序引物,利用设计的特异性引物扩增各测试材料的特异基因片段并进行焦磷酸测序.[结果]该检测方法对大豆过敏原成分具有非常好的重现性和特异性,测序结果在GenBank中进行同源性比对分析,表明目标序列能够作为鉴定GlymBd 30K基因很好的序列.[结论]为食品中的大豆过敏原成分快速检测提供很好的技术支撑.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P29-31,49)【关键词】焦磷酸测序;大豆;过敏原;PCR【作者】金莹;房保海;刘新亮;孙涛;贾俊涛;赵丽青;孙雯娴【作者单位】黄岛出入境检验检疫局,山东青岛266555;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;黑龙江出入境检验检疫局,黑龙江哈尔滨150001;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002;山东出入境检验检疫局技术中心,山东青岛266002【正文语种】中文【中图分类】S188大豆是一种常见的食品过敏原，被称为八大类食品过敏原之一，美国、欧盟等都要求在食品标签中强制性标识。
大豆GlymBd 30K蛋白是大豆的主要过敏蛋白，也被称为P34蛋白或30K，广泛存在于所有大豆品种中。
研究表明，65%的大豆过敏症状都是由GlymBd 30K蛋白引起的，因此GlymBd 30K蛋白被视为大豆蛋白中一个重要的免疫显性过敏原［1－3］。
早在1998年Takano就在 NCBI数据库中提交了大豆GlymBd 30K的DNA序列(AB013289)，而2006年研究者［4］在NCBI的核酸数据库中提交了大豆GlymBd 30K的mRNA序列(DQ324851)。
焦磷酸测序技术简介及临床意义
焦磷酸测序技术简介及临床意义
PyrosequencingTM (焦磷酸测序技术)是一种基于4种酶的级联反应来进行定量序列分析的技术。
通过对病人样本DNA序列的直接测定，从而与已知DNA序列进行对照，从而对病人的病情作出判断。
不仅可以指导临床用药，甚至可以对未来的病情发展做出预测。
目前焦磷酸测序技术越来越多的应用在病毒的分型和耐药分析、微生物快速鉴定和肿瘤的个性化治疗中。
与传统的检测方法相比，焦磷酸测序技术由于是直接得到目的核酸片段的序列，所以又被称为分子诊断中的“金标准”。
焦磷酸测序技术原理及应用
焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。
焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技术操作平台。
一.焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。
焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。
焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。
反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。
1.每次加入一个dNTP,在聚合酶作用下产生一个焦磷酸（PPi）；2.硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比).3.多余的dNTP被降解，开始新一个循环.4.测序结果2.技术平台：QIAGEN公司PyroMark Q24，PyroMark Q48Autoprep，PyroMark Q96ID焦磷酸测序仪.3.焦磷酸测序实验流程4.焦磷酸测序技术应用1)DNA甲基化检测2)全基因组甲基化水平检测：LUMA法4.SNP定量检测/等位基因差异表达检测。
食源性致病菌焦磷酸通用引物测序方法的建立
引物同时鉴别 ４种食源性致病 菌， 测序 结果与数据库 比对判断细菌种属。 结果表 明 ： 建立的检测方 法可在 ４ ｈ内完成 对 ４种 菌的鉴定 ， 测序鉴定结果与 国标 的传统 生化 方法完全一致 ， 焦磷酸测序技术 可用于食 源性 致病 菌的检 测和鉴
定。
关键词 ： 食 源性 致病 菌 ； 焦磷 酸 测序 技 术 ； 通用引物； １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ
Ｔｈ ｅ Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｆ Ｐｙ ｒ ｏ ｓ ｅ ｑｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎｇ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｂｙ ｔ ｈｅ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ａ ｌ Ｐｒ ｉ ｍｅ ｒ ｓ ｆ ｏ ｒ Ｆｏ ｏ ｄ －ｂ ｏｒ ｎ ｅ Ｐａ ｔ ｈｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ Ｂａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ
摘 要 ： 建 立 一 种 利 用 焦 磷 酸 测 序 技 术 检 测 和 鉴 定 沙 门 氏 菌 （ Ｓ ａ ｌ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ｌ ａ ） 、单核 细胞 增 生 李斯 特 菌 （ Ｌ ｉ ｓ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｌ ｆ ｏ ￣ ｓ ） 、 金 黄 色 葡 萄球 菌 （ Ｓ ｔ ａ ｐ ｈ ｙ ｌ ｏ ｃ ｏ ｃ ｃ ｕ ｓ ａ ｕ ｒ ｅ ｓ） ｕ 和 志贺 氏菌 （ Ｓ Ｚ ｆ ｎ ） 的方法。 通 过 对 ４种 茵 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ的 保 守 序 列 可 变 区 的 同 源性 分 析 ， 设 计 出一 套 适 合 焦磷 酸 测序 的 扩增 引物 和 测 序 引物 ， 通 过 可 变 区住 点 差 异 ， 利 用 一 套 通 用
生 物工 程
食品研究与开发
Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ａｎ ｄ Ｄｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍｅ ｎ ｔ
２ ０ １ ３年 １月
几种食源性致病菌快速检测技术研究
几种食源性致病菌快速检测技术研究随着生活水平进一步提高，人们越来越重视食物安全性。
资料证实，致病菌是诱发食品安全的重要危险因素。
本文简单列举几种常见食源性致病菌，并从当前食品检测技术入手，分析食源性致病菌快速检测技术。
标签：食源性致病菌；快速检测技术食品安全是现阶段人们普遍关注的一个社会问题，近几年，我国食源性致病菌爆发几率不断上升，给人们生命财产安全造成严重威胁。
国家有关部门指出，2013年度我国共出现食源性致病菌感染1.3万例，导致132人死亡。
因此，加强对食源性致病菌检测技术的讨论更具有实际意义。
现阶段，沙门氏菌、志贺氏菌与金色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，本文以常见致病菌检测为基点，探讨快速检测新技术的应用。
一、传统检测方法传统分离法是一种常见的食源性致病菌快速检测方法。
该检测方法主要分为：致病菌培养、平板分离、生物学鉴定等步骤。
该检测方法由于步骤繁杂、时间长难以适应现代致病菌检测需要。
近几年，部分学者在传统分离法的基础上，相继推出API、BLOLOG等检测技术，简化了生物检测流程，但由于这些技术主要依靠颜色变化判断致病菌情况，若颜色不明显，则检测效果的准确率会大幅度降低，其结果带有一定主观性。
随着显色培养基技术发展，传统检测方法又得到进一步发展，通过特定的显色产物，使不同菌落在检测中会显示不同颜色，而杂菌则不显示颜色，这种方法具有较高的应用价值。
二、新型检测方法1、免疫胶体金检测技术免疫胶体金技术主要依靠胶体金进行检测的一种免疫标记技术。
氯金酸在还原剂影响下，进行分离、组合，成为具有特定比例的颗粒，这种颗粒在静电影响下成为一种稳定的胶状物质，故被称为胶体金。
在快速检测过程中，待检物品会吸附到胶体表面，并被胶体标记，标记下的显色程度与待检物品中的食源性致病菌数量成正比。
该检测方法具有检测速度快，精准度高等特点，并且检测过程不需要检测设备投入。
部分学者通过胶体金标记技术原理，结合双抗体夹心免疫技术，研制出金色葡萄球菌检测方法，能在8min中完成检测。
运用454焦磷酸测序技术对病原菌16S-rDNA的分析
运用454焦磷酸测序技术对病原菌16S-rDNA的分析林萍;周与华;李擎天;郭晓奎【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2011(026)006【摘要】目的探讨运用测序技术鉴定临床感染标本中病原菌的应用价值.方法运用聚合酶链反应(PCR)扩增及454焦磷酸测序技术,对标本中病原菌16S- rDNA V3区进行多样性分析;并与细菌培养结果相比较.结果测序能检测出临床不宜培养的菌属,如支原体属、嗜血杆菌属、莫拉菌属等;9种菌属为2种方法共同检测所得,7种菌属的P值均<0.05.结论 2种方法的检测敏感性差异有统计学意义;与细菌培养相结合是临床实践中的一种新的偿试.【总页数】4页(P364-367)【作者】林萍;周与华;李擎天;郭晓奎【作者单位】上海交通大学医学院附属精神卫生中心检验科,上海,200030;上海交通大学医学院病原生物学教研室,上海,200025;上海交通大学医学院检验系,上海,200025;上海交通大学医学院病原生物学教研室,上海,200025【正文语种】中文【中图分类】R446.5【相关文献】1.基于16S-rDNA序列的核桃细菌性疫病病原菌遗传多态性分析 [J], 傅本重;陈倩倩;魏蜜;朱洁倩;杨新河;李国元;邹礼平;汪殿蓓2.应用焦磷酸微测序技术行HLA-DRB基因型分析 [J], 袁建林;武国军;薛丽;赵锦荣;白玉杰;杨芳;王禾;张运涛;杨力军3.应用454测序技术分析种植制度对黑垆土微生物多样性的影响 [J], 蔡艳;郝明德;张丽琼;臧逸飞;何晓雁4.运用454焦磷酸测序技术对断奶前后仔猪肠道菌群的分析 [J], 王一冰;张小平;黄怡;李卫芬5.T-RFLP和454焦磷酸测序方法分析制麦过程细菌群落的动态变化 [J], QIU Ran;LU Jian因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR-焦磷酸测序技术在HPV型别检测中的应用
PCR-焦磷酸测序技术在HPV型别检测中的应用陈秀杰;段蒙;班蕊;周莉美;曲芃芃【期刊名称】《现代妇产科进展》【年(卷),期】2014(0)4【摘要】宫颈癌是严重危胁妇女生命健康的最常见恶性肿瘤之一,全球每年新发病例约52.98万,死亡病例25.51万,80%发生在发展中国家[1]。
早期宫颈癌如能及时发现并治疗,治愈率可达90%以上。
高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病因素,不同HPV亚型引起宫颈癌的危险性不同,其中HPV16和HPV18是致癌能力最强的基因型,70%的浸润性宫颈癌与其相关[2]。
因此,HPV感染筛查及型别检测是预防和控制子宫颈癌的重要手段。
对30~65岁已婚妇女而言。
【总页数】3页(P323-325)【关键词】焦磷酸测序技术;宫颈液基细胞检测;人乳头瘤病毒;基因型别【作者】陈秀杰;段蒙;班蕊;周莉美;曲芃芃【作者单位】天津医科大学;天津市中心妇产科医院【正文语种】中文【中图分类】R737.33【相关文献】1.一管式多引物焦磷酸测序技术在HPV分型检测中的应用 [J], 钟丹;薛群;王淑一2.PCR-焦磷酸测序技术检测奶牛乳房炎4种主要致病菌方法的建立 [J], 剧慧栋;李月颖;张乐祎;李秀娟;赵宝华;徐保红3.应用PCR-焦磷酸测序技术快速检测小反刍兽疫病毒 [J], 王彩霞;杨贝娜;赵昱林;张永宁;吕继洲;冯春燕;袁向芬;邓俊花;吴绍强4.尖锐湿疣组织中HPV型别检测及HPV11型L1基因的克隆与测序 [J], 庄敏;谷鸿喜;魏兰兰;刘希君;李迪;崔洪波;孔卫兰5.利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌 [J], 杨会勇;那广水;朱术会;邹秉杰;奚涛;周国华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
致病菌PCR快速鉴定研究进展
致病菌PCR快速鉴定研究进展
杨浩民;王旭;刘卫东;胡风庆
【期刊名称】《中国公共卫生》
【年(卷),期】2007(23)9
【总页数】2页(P1148-1149)
【关键词】致病菌污染;美国食品与药品管理局;快速鉴定;PCR;食品供应;大肠埃希菌;致病微生物;相关行业
【作者】杨浩民;王旭;刘卫东;胡风庆
【作者单位】贵州大学生命科学院;辽宁省铁岭市动植物产品检验检疫局;辽宁大学生命科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】R155.3
【相关文献】
1.食源性致病菌多重PCR快速检测研究进展 [J], 余倩;黄梦娜
2.PCR-焦磷酸测序法快速检测和鉴定临床常见致病菌的研究 [J], 孟成艳;金嘉琳;雷建强;王莹;张舒;张文宏
3.PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定 [J], 王英;刘维达;顾军;赵敬军;陶苏江;吕桂霞
4.多重PCR技术在快速检测食源性致病菌中的研究进展 [J], 于世成
5.多重荧光PCR快速检测食源性致病菌的研究进展 [J], 刘占鳌;裴艳琴;叶华
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中图分类 号 ： Ｑ ７ ８ １ 文 献标志 码 ： Ａ 文 章编 号 ： １ ６ ７ ３ —１ ６ ８ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ —０ １ ８ ２ 一Ｏ ７
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焦磷酸测序技术在 ４ 种食源性致病菌 快速检灏Ｉ Ｊ 中的应用
赵 新， 王 永 ， 兰青阔 ， 陈 锐， 朱 珠， 余景会 ， 李 欧静 ， 郭 永 泽
（ 天津 巾农 业科 学 院 ｆ ， Ｃ 盼空 ， 天津 ３ ０ ０ ３ ８ １ ）
摘要 ： 为建 立一 种利 用 焦磷 酸测 序技 术检 测和鉴 定 沙 门氏菌（ Ｓ ａ ｌ ｍｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ｌ ａ ） 、 单核 细胞增 生李斯 特 菌（ Ｌ ｉ ｓ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｍｏ ｎ ｏ ｃ ｙ ｔ ｏ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ） 、 金 黄 色葡 萄球 菌 （ Ｓ ｔ ａ ｐ ｈ ｙ ｌ Ｏ Ｃ Ｏ Ｃ Ｃ ￣ ￥ａ ｕ ｒ ｅ ｕ ｓ ） 和志贺氏茵（ Ｓ Ｚ ） 的方 法， 通过 对 ４种 菌毒 力靶基 因特 异 性序 列 的 同源性 分 析 ， 设计 出适合 焦磷 酸 测序 特 异性 扩增 和 测序 的 引物 ， 摸 索 出最佳 的 焦磷 酸 测序 反 应体 系和反 应程 序 ， 并 建 立 了 ４种 食 源性 致病 菌焦磷
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酸测 序快速 检 测方 法。此 方 法以传 统 国标 法 的前增 菌为前提 ， 而省 去 了后 期 生化 验证 的繁 琐过 程， 大 大缩短 了检测 时 间 ， 并且 其 准确性 与传 统生 化验证 完全一 致 ， 灵敏度 可达 １ ０ Ｃ Ｆ Ｕ ／ ｍＬ 结
果表 明 ， 作 者建 立的 焦磷 酸测 序检 测 方 法具 有 高效 、 快速 、 精 准及 操 作 简便 等特 点 ， 为食 源性 致 病 菌的 快速鉴 定开辟 了广 阔的前景 关键 词 ： 食 源性致 病 菌 ； 焦磷 酸测序 技 术 ： 检 测
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