第六章 多底物酶促反应动力学

但有时当直线延长相当距离会出 现相交而不能确定是否乒乓机制，也 可能是顺序机制。
如测定逆向反应的动力学也同样 获得两组平行线，或证实其半反应中 有同位素交换即可获得进一步确定。 双倒数作图法产生的复合函数， 为两个未知数，只能通过二次作图， 求KmA,KmB,Vm
第六章 多底物 酶促反应动力学
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EAB只能来自EA，而不是EB， A是一个领先底物（第一底物），
B是随后底物（第二底物） 有其顺序性。
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2. 异形有序反应： 酶的形式有改变，其速度方程不同 于上述的速度方程。
A B P Q
E
EA
(EAB---FPQ)
FQ
F
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还有其酶促反应，中心过渡态络合物形成很慢， 而分解速度很快。被称为Theorell Chance反应： 即形成中间物的速度极慢而分解速度极快。 A B P Q
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1 KmA 1 1 KmB = + (1 + ) v Vm [A] Vm [B]
y=ax+b
当A无穷大时变成单底物反应的米氏方程。上 式一项可去除，与A无关，为单底物米氏方程。 为y = ax+b的直线方法, 其双倒数方程：
当A=∞,
1 V
=
KmB 1 Vm [B]
+
中心复合物：
指酶活性中心全部被底物占居
命名：（EAB-------------------------EPQ） E: 稳态酶， EAB和EPQ:中心过渡态中间物
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6.3 多底物酶促反应的表示方法、命名和举例
1) 有序顺序反应： xxxxxxx-------- 底物、产物 规定： 反应历程 OOOOOOO------酶存在形式
= V Vm
1 V
+
[A] 1 Vm
当A=∞,
=
KmB 1 Vm [B]
+
Vm
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具体实验方法： 以A、B双底物反应作为例子，可将 底物B固定在几个不同浓度下。 固定在某一B浓度时，测不同A浓度 对反应速度影响； 也可固定A在某一浓度，测定不同B浓 度对反应速度影响，再分别作双倒数图。
E 例子： NAD+ EA 乙醇 乙醛 EQ NADH E
E
E-NAD+
E-NADH
E
E：为马肝 醇脱氢酶
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为什么有顺序性？ 被认为酶上与第二底物结合 位点原先在酶结构内部(中间)， 第二底物无法与之结合。 由于第一底物结合改变了酶 原有结构，暴露了酶结构上第二 底物结合位点，使酶上第二个结 合位点能够顺利地与B结合。 A,B的结合是在酶的不同位点上。
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底物动力学方法： 有序顺序机制推导法是用图象法推出。 在稳态条件下推出的双底物反应速度公式：
V[A][B]
V=
KmB[A] + KmA[B] + KiaKmB + [A][B]
是底物A与酶E结合的解离常数。
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解释公式中几个常数： 多底物反应中，一底物的米氏常数 可随着另一底物浓度变化而变化。 KmA[B]：指底物[B]浓度达饱和，底物 A的米氏常数。在底物B低于饱和 浓度时，测得随底物[B]而变化的A 的各个Km，称为表观米氏常数Km KmB[A]: 指底物[A]浓度达饱和，底物 B的米氏常数。在底物A低于饱和 浓度时，测得随底物[A]而变化的B 的各个Km，称为表观米氏常数Km
1 Vm
当B无穷大时变成单底物反应的米氏方程。上式 一项可去除，与B无关，为单底物米氏方程。
1 KmA 1 1
当B=∞,
V
=
Vm [A]
+
Vm
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乒乓机制动力学双倒数作图： 用上述双倒数作图法，如能获得下图的 两组平行线，即乒乓机制的特征。
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Cleland分析大量动力学数据，总结两条重 要规则： 1. 浓度变化的底物和一种形式的酶结合， 抑制性产物和另一种形式的酶结合。 双倒数作图,只有纵坐标截距变化。
2. a) 浓度变化的底物和抑制性产物都结合 在同一个酶上。双倒数作图则产生斜率 变化。 b)浓度变化的底物所结合的酶形式和抑 制性产物结合的酶形式间可在酶的反应 历程中通过可逆变化而互相联接。双倒 数作图产生斜率变化。
Suc磷酸化酶
G-1-P + 32Pi ======== G-1-32P + Pi 研究认为，这种现象是蔗糖磷酸化酶的 乒乓机制造成, 转移葡萄糖基。
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1
Kia KmB [A][B] = + + + v Vm[A][B] Vm[A][B] Vm[A][B] Vm[A][B]
1 = K mB KmA Kia KmB + + 1
K mB[A]
KmA[B]
+
v
Vm[B]
1
Vm[A]
KmA 1
Vm[A][B]
1
Vm
当B=∞,
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3.同位素交换法 下面简单阐述同位素交换法在研究多 底物动力学上的应用。 先举一个例子：
蔗糖磷酸化酶
葡萄糖-1-P + 果糖 =======蔗糖 + H3PO4 这个反应是可逆反应。在没有果糖时， G-1-P 可以与32P标记的KH232PO4发生交 换，表明有下面的反应：
截距=KmA/KmBKsA 斜率=KsAKmB/Vm
截距=KmA/Vm
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1/V的截距 斜率=KmB/Vm 截距=－1/KmB 截距=1/Vm
上面的方法只能判别顺序机制中的有 序和快速平衡的随机机制，但是无法区 分有序和随机机制，只能通过其他方法 来判别。
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2.随机顺序反应（Randan BiBi）：
A A
E-A
B
P
E-Q
Q
E
E-B
EAB-----EPQ
A
E-P
E
B
Q
P
例子
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3.乒乓机制： 特点： 1．不形成三元络合物，底物不同时与酶 结合。 2．在全部底物与酶结合前，已经有一种 放出来。由于底物、产物一进一出， 所以像打乒乓一样，叫乒乓机制。 A E (EA—EP) P F B Q (EB---EQ) E
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Lineweaver-Burk双倒数作图： 当固定几个不同的B浓度或者几个不同 的A浓度时，作1/[A] ---1/v 和1/[B ] ---1/v 的关系图，得到如下图。
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直线的交点在坐标的左侧，这是顺序机制的特点。 且交点可在横坐标的的上方、下方或者线上。 1. 在横坐标上面，表明固定底物B或A与酶结合 不影响 可变底物A或B的Km，即B或A浓度 大小互不影响各自的Km,说明表观 Km app= Km,KmA=Kia, KmB=Kib 2. 在横坐标下方，表明可变底物A的表观 Km 随 B的增加 而增加，KmA＜Kia，KmB＜Kib 3. 在横坐标上方，表明可变底物A的表观 Km 随 着B的增加而减少，KmA表明可变底物A的 表观 Km 随着B增加而增加，KmA＞Kia, KmB ＞Kib
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判别乒乓机制问题： A P
E Glu (EA—EP) F
B (EB---EQ)
Q E
α-酮戊二酸 丙酮酸
Ala
E (E-Glu-F-α-酮戊二酸) F ( F-丙酮酸-F-Ala) E
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Cleland判断有序和随机机制，
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谷丙转氨酶的作用：
谷氨酸 α-酮戊二酸 丙酮酸 丙氨酸
E (E-谷氨酸-F-α-酮戊二酸) F ( F-丙酮酸-F-丙氨酸) E
7.4 多底物动力学机制判别： 因为是双底物反应，所以需要加以判别多 底物动力学机制属哪类机制，用三种方法。 1) 底物动力学方法 2) 产物抑制动力学方法 3）同位素交换方法
其反应历程如下：
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规律总结如下：
1 [A]固定底物，[B]变化底物，[p]=0, [Q]=常数 2 [A]固定底物，[B]变化底物，[p]=常数, [Q]=0 1 [B]固定底物，[A]变化底物，[p]=0, [Q]=常数 2 [B]固定底物, [A]变化底物，[p]=常数, [Q]=0
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上述方法适用： 顺序机制中有序机制及 快速平衡的随机机制， 但不能区别顺序机制还 是随机机制。
需要进一步使用其他方 法才能把它们区别开来。
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产物抑制动力学方法是其中之一。
产物抑制：是鉴别多底物反应属有序、随机 还是乒乓机制起重要作用。特点：方法简便。 A+B==P+Q，采用几个P浓度或不加P， 测每个P浓度或不加P时不同[A]（固定B）及 不同[B]（固定A ）对反应速度的影响，再以 Q代替P，重复以上实验。 最后以实验结果作双倒数图， 不同P时，1/[A]对1/v或1/[B]对1/v， 及不同[Q]时，1/[A]对1/v或1/[B]]对1/v作图。 看P、Q的抑制方式是竞争性还是非竞争性和 反竞争性，然后综合分析来判别。
6.2 多底物反应基本命名法 1963年由Cleland建议建立的 1)按底物和酶结合次序为A、B、C表示 2)按产物在酶上释放次序为P、Q、R表示 3)稳态物（包括酶）以E、F、G表示 非中心复合物： 指酶活性中心没有全部被底物占居 ENAD+ ENADH EA EP
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1/v 1 = 1/v 2 Kia /[A][B]1+1/[B]1 )= (Kia /[A][B]2+1/[B]2) Kia/A(1/[B]1-1/[B]2)=－ (1/[B]1 -1/[B]2) 1/[A]=-1/Kia
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1/[A] == 1/Kia 斜率, 截距都可用此法取得。 问题：从作图看出，从直线方程取得的 是复合未知数，要用二次作图法 求出KmA，KmB，Vm。 斜率
4双底物
氧化还原酶
AH2+B == A+BH2
A2++B3+ == A3++B2+ A+BX == A X + B
A+B+ATP=AB+ADP+Pi
27
基团转移
5三底物 连接酶
24
6
A+B+ATP=AB+AMP+Ppi
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单底物反应动力学指1,3, 2的正向反应(约40%) 其余多底物反应多为多底物反应(约60%)
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多底物酶促反应动力学
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6.1
酶促反应按底物数的分类
国际酶学委员会把酶六大类反应对应于底物的分类如下： 底物数 酶分类 作用类型 占酶总数 % 1单底物 异构酶 A== B 5 2单向单底物 裂合酶 A== B+C 12 3假单底物 水解酶 A-B+H2O==A-OH+BH 26
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且交点在1/[A]上截距可计算出来。 设有两个固定浓度[B]1,[B]2,有两个
相应的1/v1,1/v2,而且在交点处的截 距相等
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1
v 1 =
KmB
Vm[B] 1
+
KmA
Vm[A] Vm[A][B] Vm
+
Kia KmB
1
+
KmA Kia KmB KmB = ( + +1+ ) v 1 Vm [A] [A][B]1 [B]1 1 KmA Kia KmB KmB = ( + +1 + ) v 2 Vm [A] [A][B]2 [B]2 1
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Cleland分析大量动力学数据，总结两条重要规则：
应用Cleland方法方法的关键： 看产物是否抑制和抑制方式，取决 于抑制性产物是P或Q中的哪一个？
如浓度变化的底物是那一个，A或B？ 同样，与另一个固定浓度的底物是 否饱和有关。 实验结果与判断结果一致。全部 结果列表于下。
乒乓机制速度方程和动力学常数： 求解动力学方程用King—Altman图象法推出。 通过平衡学说推出的方程：
经过双倒数后， 1 KmA[B] KmB [A] [A][B] = + + v Vm[A][B] Vm[A][B] Vm[A][B] 1 K源自文库A KmB 1 = + + v Vm[A] Vm [B] Vm