小鼠肝细胞彗星实验试剂配制及步骤

小鼠肝细胞彗星实验试剂配制及步骤

①1%正常熔点琼脂糖NMA：10mL 0.1g NMA (PBS配制) 微波炉加热

②0.7%低熔点琼脂糖LMA：10mL 0.07g LMA (PBS配制) 水浴锅37℃保温

③细胞裂解液（4℃）：（2.5mM）NaCl +（100mM）Na2EDTA +（10mM）Tris 调pH=10

1000mL：146.1g NaCl 37.22g Na2EDTA 1.22g Tris

500mL：73.05g NaCl 18.61g Na2EDTA 0.61g Tris （配500mL：先300mL灭菌水溶解4g NaOH ，加热溶解，然后加其他，调pH=10）

④电泳缓冲液（现用现配，可先配10×）：（1mM Na2EDTA + 300mM NaOH pH＞13）

10×：100mL：0.3722g Na2EDTA + 12g NaOH

300mL：1.1166g Na2EDTA + 36g NaOH

⑤中和缓冲液：0.4mol/L Tris-HCl (pH=7.5)

1000mL：48.456g Tris，尽量少水溶解，HCl 调pH 7.5

500mL：24.228g Tris

⑥EB染色剂（4℃暗处保存）：2ug/mL 先配10×: 20ug/mL

10×：100mL：0.2g EB 蒸馏水稀释

步骤：①脱颈处死取小鼠肝0.5g，PBS冲洗，冰上剪碎→10mL EP管→加5ml PBS溶液匀浆，过四层纱布，离心：1000r 10min 4℃。弃上清液，重新悬浮加5ml PBS。

②1%NMA 100ul加到载玻片上（水浴锅上预热防凝），盖上盖玻片迅速低温。

③700ul 0.7% LMA + 200ul 悬浮液→1.5mL EP管，取90ul加到载玻片上，盖上盖玻片低温。

④放入细胞裂解液，4℃冰箱裂解1h 至1.5h。

⑤水洗三次，电泳液中中和20min，电泳。20v 200mA 20min

⑥水洗三次，中和缓冲液中和2-3次每次5Min。

⑦水洗两三次，EB暗处染色10min. 水洗两次稍晾干，荧光显微镜下观察。