癌相关成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用对肿瘤发生发展的影响

肿瘤细胞培养方法和培养基

肝癌细胞培养 一、培养基 1、RPMI-1640+10%胎牛血清培养基 2、DMEM+15%胎牛血清培养基 成分表

二、实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 1、玻璃器皿的清洗灭菌（5％盐酸溶液、重鉻酸钾120ml、硫酸200ml、蒸馏水200ml）：（1）浸泡:新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后经行烘干。 （3）酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。（4）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

2、橡胶制品清洗消毒： 0.5mol/L NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5mol/L HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用 3、塑料制品的清洗消毒（瓶盖、离心管）： 使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，用纱布或棉签和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15分钟，流水冲洗（15－20遍）,蒸馏水浸洗三次，双蒸水泡24小时，晾干备用。 三、细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培养液。 实验人员穿上无菌实验室操作服用酒精喷于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭实验台（1）取一15ml离心管用滴管在其内滴加5--9ml培养液（取8ml）。 （2）从液氮罐中取出冻存管，并迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s 内完成。 （3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液转移入上述离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来）。 （4）低速离心(1000r／min) 5min，去上清后再用8ml培养液再清洗离心一次。 （5）离心后倒掉上清液，在离心管中滴加3ml培养液（RPMI-1640），混匀（可用滴管轻柔吹打）。 （6）将离心管中的混合液转移到培养瓶中，并在培养瓶中滴加15滴10%小牛血清，盖上瓶盖，标好细胞种类和日期、培养人姓名等，将培养瓶平放，置于37°C培养箱中培养。2-3天换一次培养基。 四、细胞传代： 当观察到培养瓶中细胞铺满度为90%时（细胞生长处于对数期时），解冻复活成功后的细胞要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。 （1）试验台的消毒工作准备好，弃去旧培养液，用PBS液（不含钙，镁离子）洗1-2次，以免剩余培养液影响胰蛋白酶活性。（细胞贴壁生长）。 （2）向瓶内加入1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mEDTA），置于37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，1--3min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化（将培养瓶翻转过来，以保证细胞没有脱壁）。 备注：若细胞没有脱壁，生长良好，则直接倒掉消化液，加培养液8ml，离心收集细胞；若发现很多细胞已解离已脱壁（即解离过度），则直接加培养液进行离心收集细胞。 （4）倒出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量（约2ml），轻轻转动培养瓶，把残留胰蛋白液消化液冲掉，然后再加3ml培养液+15滴小牛血清。 （5）使用吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。 （6）将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1000r／min) 5min。 （7）将离心后离心管中液体倒掉，在离心管中加入3ml培养液，并反复吹打细胞，制成细胞悬液。

完整word版,人教版高一生物下册《细胞的癌变》知识点总结,推荐文档

人教版高一生物下册《细胞的癌变》知识点 总结 一、癌细胞的概念：有的细胞受到致癌因子的作用，细胞中遗传物质发生变化，就变成不受机体控制的、连续进行分裂的恶性增殖细胞。 二、癌细胞的特征 (1)在适宜的条件下，癌细胞能够无限增殖体细胞能分裂 50-60 次 (2)癌细胞的形态结构发生显著变化癌变后球形的成纤维细胞癌细胞的分散和转移示意图癌症为什么难治? 由于细胞膜上的糖蛋白等物质减少，使得癌细胞彼此之间的黏着性显著降低，容易在体内扩散和转移 (3)癌细胞的表面发生变化 三、细胞癌变的原因 (1) 物理致癌因子： 辐射(紫外线、X射线、电离辐射等) 1、致癌因子 日本广岛、长崎在第二次世界大战时受原子弹的影响。幸存的居民皮肤癌、白血病发生率明显增加。 切尔诺贝利核电站核泄漏，诱发众多白血病患者。图为

悲惨的受害者居里夫人在研究工作中长期被放射性射线损伤，导致白血病 (2) 化学致癌因子： 无机物- 如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等; 有机物- 如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、苯、联 苯胺、煤焦油、苯并芘等 (3) 病毒致癌因子：感染人的细胞，将其基因整合进入人的基因组，诱发癌变 如：感染乙肝病毒可诱发肝癌; 感染人乳头状病毒可诱发宫颈癌; EB 病毒是一种疱疹病毒，使儿童患淋巴癌、成人患鼻咽 癌。 2、内因遗传因素 抑制细胞不正常的增殖。 负责调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程。A. 原 癌基因 B. 抑癌基因 肿瘤细胞正常细胞为什么会转化成癌细胞?癌细胞正常 细胞原癌基因 抑癌基因突变突变癌基因失去抑制作用不能控制 （致癌因子的作用）不受控制，恶性增殖 四、癌症的预防

肿瘤细胞的研究进展

肿瘤细胞的研究进展 关键词：循环肿瘤细胞、研究进展、治疗 学号:24520132204189 姓名：蔡茂宇 摘要：循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是指进入人体外周血的肿瘤细胞。是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因. 近些年, 随着技术的不断改进, CTCs检测作为一种新型的非侵入性诊断工具, 在早期发现患者术后复发与远处转移、评估疗效与预后等方面的应用价值已成为临床研究的热点. 本文简要综述近年CTCs检测的研究进展及其临床应用状况早在1869年, Ashworth发现血液中的一种血细胞同尸检发现的肿瘤细胞相似, 首次提出CTCs的概念. 目前CTCs定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞. 进入循环未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓, 并在一定条件下发展为转移灶. 近年来, 随着人们对肿瘤转移机制研究的深入, 以及检测技术的不断改进, CTCs的检测已取得了 一些突破性的进展, 部分检测方法在稳定性、敏感性及特异性等方面均已较理想, CTCs的临床应用研究也已取得明显进展. 目前CTCs的检测方法众多,根据检测原理可分两大类: 细胞计数法(cytometric methods)和核酸检测法(nucleic-acid based methods). 前者主 要包括各种免疫细胞化学技术、流式细胞术等; 后者主要包括聚合酶链反应、逆转录聚合酶链反应及其各种改进的技术等. 免疫细胞化学法(immunocytochemistry, ICC) ICC是指以显色剂标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学的呈色反应, 对相应抗 原进行定位、定性和定量测定的技术. 其检测的肿瘤标志物主要分3类: (1)上皮细胞角蛋白(CK), 如CK19、CK20; (2)上皮细胞膜特异性抗原, 如黏蛋白 类, 包括EMA、HMFG、HEA-125等; (3)肿瘤相关糖蛋白(TAG). ICC检测的主要 优点是可进行细胞大小和形态学的分析, 缺点是敏感性低, 只能从(1-10)×105个正常细胞中发现1个肿瘤细胞, 且应用免疫细胞化学法检测循环血中肿瘤细 胞时, 每个载玻片上所能检测的细胞样本量仅为5×105个细胞, 难以从外周血中大量的单核细胞中检测出极少量的肿瘤细胞, 因此单纯应用免疫细胞化学法 敏感性低,难以满足临床诊断需要. 为了能大范围检测外周血中稀少的肿瘤细胞,近年来又相继研发出光纤阵列扫描术 (fiber array scanning technology, FAST), 激光扫描细胞计量仪(laserscanning cytometry, LSC)等, 能够在传统的显微镜技术基础上高速扫 描并快速、准确的定位免疫荧光标记的肿瘤细胞, 使检测的敏感性和实效性显著提高. 流式细胞术(flow cytometry, FCM) FCM是一项集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体的新型技术. 其优点是可以定量计数肿瘤细胞数量, 检测数据较精确, 还可对细胞进行多参数分析. 何成 全等应用流式细胞术检测66例胃癌患者外周血中CK19、CK20的表达. 结果66 例胃癌患者CK19、CK20、CK19+CK20阳性表达率分别为53.1%(35/66)、 56.1%(37/66)、46.9%(31/66), 检测的阳性率与患者的TNM分期及转移程度相关, 且检测胃癌远处转移的敏感度高达90.0%. 认为应用FCM检测CK19、CK20 的表达对胃癌微转移的诊断具有一定临床意义. 但由于FCM检测靶细胞的敏感

癌细胞的十大特征

癌细胞的十大特征 2000年，Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg在Cell上发表文章：The Hallmarks of Cancer，这篇综述性文章介绍了肿瘤细胞的六大基本特征：自给自足生长信号；抗生长信号的不敏感；抵抗细胞死亡；潜力无限的复制能力；持续的血管生成；组织浸润和转移。这篇论文被称为肿瘤学研究的经典论文，到目前为止，已经被引用了上万次。 在2011年3月出版的Cell杂志上，两位教授又发表了一篇升级版综述：Hallmarks of Cancer: The Next Generation，这篇论文长达29页，简述了最近10年肿瘤学中的热点和进展，在原有的六大特征的基础上，新增了四大特征，包括避免免疫摧毁、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常和基因组不稳定和突变。

将原有的肿瘤细胞六大特征扩增到了十个，这十个特征分别是： 1.自给自足生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals）， 2.抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals）， 3.抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)， 4.潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential)， 5.持续的血管生成(Sustained Angiogenesis)， 6.组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis)， 7.避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction)， 8.促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation），

肿瘤细胞培养(完整版)

第6章肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。 但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。 一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。

肿瘤细胞的十大特征

癌细胞的十大特征 癌细胞十大特征释义 众所周知，癌细胞几乎肆虐横行在人体的每一个部位，从大脑到各个器官，从表皮到骨骼，我们曾经在进化中得到的、在生物界引以为豪的人体，在癌细胞肆虐下往往显得那么脆弱，有时似乎变得不堪一击。 癌细胞并非入侵的外族，它们与组成人体各个器官的正常细胞同文同种，但不同的是癌细 胞基因结构和功能的变化赋予了它们十种特殊“器物”，从而使得它们能够在人体内纵横 捭阖，所向披靡。 1.自给自足生长信号（Self-Sufficiency in Growth Signals）， 2.抗生长信号的不敏感（Insensitivity to Antigrowth Signals）， 3.抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)， 4.潜力无限的复制能力(Limitless Replicative Potential)， 5.持续的血管生成(Sustained Angiogenesis)， 6.组织浸润和转移(Tissue Invasion and Metastasis)， 7.避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction)， 8.促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation）， 9.细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics）， 10.基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation） 其一：生长信号的自给自足 在人体这个迄今为止最为复杂的系统中，倘若一个细胞想要改变其现有状态（如从静止到 生长分化状态的改变），必须接收到一系列相关指令，这一过程才能进行，就像军队中的 令行禁止一样。就这样，数以万亿计的细胞各司其职，在和谐统一的秩序中维系着人体的 健康。到目前为止，科学家在正常细胞中还没有发现一例例外。 这些改变细胞状态的指令，生物学上称之为信号分子，它们多是外源的，即由另一类细胞 产生，这也是人体保持自我平衡的重要机制。信号分子通过与靶细胞上相应指令接收器 （受体）相结合，细胞状态改变这一过程得以实施。 在这方面，癌细胞是截然不同的，它们通过种种“奇巧淫技”把自己对外源生长信号的依 赖降到了最低限度。首先癌细胞们获得自己发号施令的能力，也就是说它们可以自行其是 的合成生长分化所需的生长信号，无需依赖外源性信号。比如科学家们发现在神经胶母细 胞瘤和恶性肉瘤中的癌细胞就分别获得了合成PDGF（血小板源生长因子）和TGFα（肿瘤 生长因子α）的能力。其次癌细胞还会大量表达其表面的信号接收器，这样就可以富集周 围微环境中的生长信号从而进入生长分化状态（注：正常情况下，未经富集浓度的生长信 号不足以触发生长分化）。此外癌细胞还会改造它周围的一些正常细胞成为生长信号的生 产工厂供其使用，并招募一些帮凶细胞，如成纤维细胞和内皮细胞来帮助它们生长分化。 其二：对抑制生长信号不敏感 平衡似乎是人体系统中最重要的关键词。人体内除了有生长信号外，还存在着生长抑制信号。在细胞分裂的不同阶段，都有一些分子如同看家护院的“爱犬”一般时刻检测这些细 胞的“身体状况”和周边环境，根据情况来决定细胞的未来的命运：或是继续生长分化， 或是仍然处于静止期，抑或丧失生长分化能力进入有丝分裂的后期。这样正常细胞才能保 持动态平衡的状态，进行有序的生长分化。对于癌细胞来说，如果想要扩大自己的地盘， 不断地生长分化，必须逃避这些“爱犬”分子的监控。他们主要策略就是通过基因突变使 得这些“爱犬”分子失去活性，从而实现对抑制生长信号不敏感的目的。 其三：规避细胞凋亡 逃避细胞凋亡几乎是所有类型的癌细胞都具有的能力。负责细胞凋亡的信号分子大体上可 以分为两类：一类如同上文所述的“爱犬”分子，如一种名叫p53的蛋白就是其中最重要 的成员之一；另一类则负责执行细胞凋亡。前者监控细胞内外环境，一旦发现不正常情况 足以触发细胞凋亡，即指挥后者执行。目前科学研究证实，DNA损伤，信号分子的失衡以 及机体缺氧都有可能触发细胞凋亡。

肿瘤的几种转移途径

一肿瘤的转移途径： 1 淋巴道转移：（癌多见）。原发癌的细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋巴结，也可能超级转移；或因癌阻碍顺行的淋巴引流而发生逆向转移。转移癌在淋巴结发展时，淋巴结肿大且变硬，起初尚可活动，癌侵越包膜后趋向固定，转移癌阻碍局部组 织淋巴引流，可能引起皮肤、皮下或肢体的淋巴水肿；如：乳腺癌同侧腋窝淋巴结；肺癌肺门、支气管旁淋巴结；鼻咽癌同侧颈淋巴结。 2 血道转移：癌细胞进入血管随血流转移至远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继 发性肿瘤；如：瘤细胞静脉肺和肝等（最多见），形成边缘整齐、散在、多发的球形结节，中央常发生坏死，近脏器表面形成“癌脐”。 3种植性转移：内脏器官的肿瘤，侵犯浆膜后，瘤细胞脱落入体腔，种植在浆膜面 上。如：肺癌胸膜腔；消化道癌或卵巢癌腹膜腔。 形态：浆膜增厚，表面癌结，血性积液，脱落细胞学检查可见癌细胞。 4.直接转移：随着肿瘤体积不断增大，肿瘤细胞可沿周围正常组织的薄弱处，直接延伸，侵入并破坏邻近组织或器官。如：直肠癌前列腺、膀胱、子宫及阴道壁等。 二此例的转移方式： 1.胃卵巢：种植性转移，胃癌浸透到脏器外表面时，随着呼吸或肠蠕动等相应的摩擦，可脱落到体腔继续生长 2.胃、肝、肺淋巴结：淋巴道转移，肿瘤细胞侵入淋巴管后，随淋巴液转移到淋巴结，在淋巴结内生长形成转移瘤，淋巴结肿大且变硬 3.胃肺、肝脏：血道转移，肿瘤细胞侵入血管后，随血流转移到全身各处称血道转移。侵入人体静脉系统的肿瘤细胞，先转移到肺，再经心脏扩散到全身各脏器。消化 道的恶性肿瘤常入侵门静脉系统转移到肝脏。 三 (1)阻塞和压迫：肿瘤的阻塞压迫发展迅速，程度也高，如肝肿大可以压迫神经；淋巴结肿大变硬，淋巴回流受阻。 (2)破坏所在器官的结构和功能：如肝癌由于肝细胞破坏和肝内胆管阻塞，可引起全身性黄疸。 (3)侵袭破坏邻近器官：如胃癌可穿胃壁，侵犯胃周围的器官。

第八章 细胞增殖和凋亡异常与疾病

第八章细胞增殖和细胞凋亡异常与疾病 一、A型题 1．细胞凋亡的概念是 A．由体内外因素引起的细胞渐进、缓慢的病变导致的细胞死亡过程 B．由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程 C．由体内外因素诱导的一种生理性、主动的细胞死亡方式 D．由体内外因素引起的细胞急性、严重的改变导致的细胞死亡过程 E．由体内外因素诱导的一种病理性、被动的细胞死亡方式 [答案] B [题解] 细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。 2．有关细胞凋亡的生理和病理意义下列哪一项是错误的？ A．确保机体正常发育D．保证机体正常生长 B．维持内环境稳定E．发挥积极的防御功能 C．促进生物进化 [答案] C [题解] 细胞凋亡的生理和病理意义包括：①确保机体正常发育、生长；②维持内环境稳定；③发挥积极的防御功能；并不包括促进生物进化。 3．有关细胞凋亡的特征下列哪一项是错误的？ A．由较弱刺激触发，可见于生理或病理情况 B．DNA片段化，电泳时呈“梯”状条带 C．溶酶体相对完整，局部无炎症反应 D．主动过程，耗能，无需新蛋白合成 E．胞膜皱缩内陷，分割胞浆成凋亡小体 [答案] D [题解] 细胞凋亡不仅是一个主动过程，需要耗能，而且还需要有新蛋白质合成。 5．促进细胞凋亡的基因是 A．Bcl-2 D．c-myc B．Fas E．Bcl-XL C．突变型p53 [答案] B [题解] Bcl-2、突变型p53和Bcl-XL都是抑制凋亡基因，而c-myc是双向调节基因，只有Fas基因是促进细胞凋亡的基因。 6．抑制细胞凋亡的基因是（0.377，0.392，03临床） A．Fas D．Bcl-2 B．野生型p53 E．Bcl-Xs C．c-myc [答案] D [题解] Fas、野生型p53和Bcl-Xs是抑制凋亡基因，而c-myc是双向调节基因，只有Bcl-2是抑制凋亡基因。 10．细胞凋亡时发生的变化下列哪一项出现最早？ A．线粒体膜通透性增加D．核酸内切酶激活 B．线粒体跨膜电位下降E．核转录因子激活 C．凋亡蛋白酶激活 [答案] B [题解] 线粒体跨膜电位下降使线粒体膜通透性增加，随后才引起凋亡蛋白酶激活、核酸内切酶激活以及核转录因子激活。 11．细胞凋亡的双向调节基因是 A．野生型p53 D．Bcl-2 B．Fas E．Bax C．c-myc [答案] C [题解] 野生型p53、F as和Bax是促进凋亡基因，Bcl-2是抑制凋亡基因，而c-myc才是细胞凋亡的双向调节基因。 13．细胞凋亡的主要执行者是 A．核转录因子和核酸内切酶D．凋亡蛋白酶和谷氨酰胺转移酶

肿瘤干细胞培养技术

肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth

肿瘤组织无论在细胞形态和组织结构上,都与其发源的正常组织有不同程度的差异,这种差异称为异型性。

肿瘤(Tumor) 是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。 肿瘤组织无论在细胞形态和组织结构上，都与其发源的正常组织有不同程度的差异，这种差异称为异型性。异型性是肿瘤异常分化在形态上的表现。异型性小，说明分化程度高，异型性大，说明分化程度低。区别这种异型性的大小是诊断肿瘤，确定其良、恶性的主要组织学依据。良性肿瘤细胞的异型性不明显，一般与其来源组织相似。恶性肿瘤常具有明显的异型性。 由未分化细胞构成的恶性肿瘤也称为间变性肿瘤，间变是指恶性肿瘤细胞缺乏分化，异型性显著。间变性肿瘤具有明显的多形性，瘤细胞彼此在大小和形状上有很大的变异，因此往往不能确定其组织来源。间变性肿瘤一般具有高度恶性。 我们中国医疗的特色是既有西医又有中医。现在发病率高，我国病例数相当庞大，有资料显示占全世界病例数的55%. 肿瘤在本质上是基因病。各种环境的和遗传的致癌因素以协同或序贯的方式引起DNA损害，从而激活原癌基因和(或)灭活肿瘤抑制基因，加上凋亡调节基因和(或)DNA修复基因的改变，继而引起表达水平的异常，使靶细胞发生转化。被转化的细胞先多呈克隆性的增生，经过一个漫长的多阶段的演进过程，其中一个克隆相对无限制的扩增，通过附加突变，选择性地形成具有不同特点的亚克隆(异质化)，从而获得浸润和转移的能力(恶性转化)，形成恶性肿瘤。 分子生物学基础 (l)癌基因 1)原癌基因、癌基因及其产物 癌基因是具有潜在的转化细胞的能力的基因。由于细胞癌基因在正常细胞中以非激活的形式存在，称为原癌基因。原癌基因可被多种因素激活。 原癌基因编码的蛋白质大都是对正常细胞生长十分重要的细胞生长因子和生长因子受体，如血小板生长因子(PGF)，纤维母细胞生长因子(FGF)，表皮细胞生长因子(EGF)，重要的信号转导蛋白质(如酪氨酸激酶)，核调节蛋白质(如转录激活蛋白)和细胞周期调节蛋白(如周期素、周期素依赖激酶)等。 2)原癌基因的激活 原癌基因的激活有两种方式：①发生结构改变(突变)，产生具有异常功能的癌蛋白。②b.基因表达调节的改变(过度表达)，产生过量的结构正常的生长促进蛋白。 基因水平的改变继而导致细胞生长刺激信号的过度或持续出现，使细胞发生转化。 引起原癌基因突变的DNA结构改变有：点突变、染色体易位、 诊断-影像学方法基因扩增。突变的原癌基因编码的蛋白质与原癌基因的正常产物有结构上的不同，并失去正常产物的调节作用。通过以下方式影响其靶细胞：①生长因子增加;②生长因子受体增加;③产生突变的信号转导蛋白;④产生与DNA结合的转录因子。

循环肿瘤细胞研究进展_任文君

循环肿瘤细胞研究进展 任文君，孙国平 (安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科，安徽合肥230022) 摘要：循环肿瘤细胞（CTCs）存在于患者外周血中，是造成肿瘤转移和复发的主要原因。外周血中的CTC是非常罕见的，要求检测方法具有高敏感性及高特异性，成为临床常规检测的巨大挑战，但是检测CTC在协助诊断、早期发现肿瘤的微转移、指导个体化治疗、评价治疗效果及预后方面上具有重要的临床意义。该文将对其检测方法及临床应用进行探讨。 关键词：循环肿瘤细胞；检测；治疗 Ashworth曾在1986年首次发现并提出循环肿瘤细胞（CTCs）的概念［1］。CTC定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞［2］。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，肿瘤细胞由原发灶脱落，侵入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在远隔脏器或原发脏器中定居，发展为转移灶［3-4］。有些播散的肿瘤细胞和微小转移灶在切除原发灶后可以保持休眠状态并在若干年后形成转移灶［5］。因此，在外周血中检测到CTC提示可能有早期转移存在，尤其是临床尚未发现的微转移病灶。 CTC的检测包括以下2个步骤：（1）富集，方法包括形态学或免疫学为基础的技术。（2）检测，方法包括细胞计数和核酸检测技术。因为CTC在外周血中是非常罕见的（1个CTC/106 107个单核细胞），富集细胞可提高检测的敏感性，富集之后则通过细胞计数或核酸检测技术利用肿瘤特异性标志物对CTC进行检测及分析。 1富集 1．1以形态学为基础的富集膜滤过分离肿瘤细胞技术（ISET）通过肿瘤细胞体积大小进行富集［6］，就像一个微孔过滤器根据CTC的大小差异使其分离，其隔离灵敏度阈值接近每毫升全血一个癌细胞［7］，其优势在于不破坏CTC的形态，利于后续对单个CTC进行形态学、免疫细胞学及遗传学特征的研究，但只适合部分肿瘤，不适合那些体积小于2倍粒细胞大小的肿瘤细胞。 基于密度梯度分离，单核细胞较其他血液成分密度低，因此可依据密度梯度差异将肿瘤细胞和单核细胞从其他血液细胞中分离出来，如Ficoll-Hypaque和Oncoquick。与传统的Ficoll 通信作者：孙国平，男，主任医师，博士生导师，研究方向：消化系统肿瘤，E-mail：sunguoping@anhmu．edu．cn 程序相比较，Oncoquick增加了多孔屏障，使得分离出的细胞更加纯化，检出率更高［8］。 由于这两种富集方法是借助细胞的物理特性，因此缺乏特异性，易导致缺乏相应体积大小及密度梯度的肿瘤细胞的丢失，同时所富集的细胞不仅含有肿瘤细胞，还存在不同种类的其他细胞（特别是单核细胞），在后续检测过程中可能会因为肿瘤细胞的异质性和基因标志物的非特异性，造成假阳性结果。 1．2以免疫学为基础的富集免疫磁性分离技术（IMS），基于特异性免疫识别原理的富集技术，是目前应用最广泛的方法，通过特异性抗体包被的磁珠与细胞表面抗原特异性结合，形成细胞抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外加磁场作用下，将CTC从血细胞中分离出来。免疫磁性分离方式有2种：阳性分选和阴性分选。阳性筛选获得目的细胞，阴性筛选去除无关细胞使目的细胞得以纯化，也可将两种模式结合，提高富集效率。这项技术最大的优势在于可保证分离靶细胞的形态和功能的完整，有利于下一步CTC的计数、免疫细胞化学、PCR 等检测。目前，免疫磁珠可达纳米级，结合时间短，灵敏度高10－7 10－6。 CellSearch系统是目前FDA唯一批准用于临床富集及检测分析的技术，是一种半自动技术，集合了免疫磁分选技术和免疫细胞化学法的分离检测技术。涂有抗EpCAM抗体的磁珠与靶细胞结合，在外加磁场作用下被保留下来，接着采用荧光标记（CK8/18/19，DAPI，CD45）来区别CTC与血细胞，CTC 标记为CK8/18/19、DAPI（+），CD45（－），随后采用半自动荧光显微镜Cell-Spotter Analyzer检测分析细胞大小和形态，最终确定CTC，只需要7．5mL血液样本，即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC。这种半自动系统能快速分析样本，并有良好的重复性。一个多中心研究，有学者提出Cell Search系统有82%的高富集率，且在乳腺癌CTC检测上有极 ［34］Ikeda T．Stem cells and neonatal brain injury［J］．Cell Tissue Res，2008，331（1）：263－269． ［35］尹国才，张长征，张淼涛，等．人胎脑神经干细胞在年幼大鼠脑内的成神经元分化［J］．中国组织工程研究与临床康复，2008，12（12）：2281－2284． ［36］Toda H，Takahashi J，Iwakami N，et al．Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats［J］．Neu- rosci Lett，2001，316（1）：9－12． ［37］吴芳，杨佳勇，张敏，等．脐血间充质干细胞移植对脑性瘫 痪儿童神经系统功能的影响：20例分析［J］．中国组织工程研究 与临床康复，2008，12（16）：3198－3200． ［38］张敏，杨万章，吴芳，等．神经生长因子配合脐血源神经干细胞移植对脑瘫患儿运动功能的影响［J］．中国误诊学杂志，2008，8（23）：5596－5597． ［39］杨万章，吴芳，张敏，等．脐血源神经干细胞移植治疗神经系统疾病临床总结和分析［J］．中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（3）：287－290． （收稿日期：2012－05－25，修回日期：2012－10－26） · 9 · 安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal2013Jan;17(1)

肿瘤新十大特征

CELL综述: 肿瘤新十大特征 Hallmarks of Cancer: The Next Generation 2011年3月4号，Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg在《Cell》发表综述，题目为：Hallmarks of Cancer: The Next Generation。整个综述29页，简述了最近10年肿瘤学中的热点和进展（例如细胞自噬、肿瘤干细胞、肿瘤微环境等），并且将过去的6个特征扩增到10个特征，新增加的4个特征为： 避免免疫摧毁(Avoiding Immune Destruction); 促进肿瘤的炎症（Tumor Promotion Inflammation）; 细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics）; 基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation）。 并且将过去的回避凋亡(Evading Apoptosis)，调整为抵抗细胞死亡(Resisting Cell Death)。 背景介绍 我们已经提出了总共6种肿瘤标志，组成了一个基本原理，它提供了一个理解肿瘤性疾病显著差异的逻辑网络(Hanahan and Weinberg, 2000)。我们的讨论中包含了这样的概念，肿瘤细胞逐渐进展成新生物，它们获得一系列标志性能力，而人类肿瘤形成的多步骤的过程可以用初始癌细胞获得使它们成为肿瘤并最终表现出恶性肿瘤的特征。 我们注意到由于附属结构的存在，肿瘤不只是癌细胞组成的岛状物。它们是由多种不同类型的细胞组成的复合物，这些细胞之间存在异质的相互作用。我们是这样描述招募来的正常细胞，它们以主要参与者的身份形成肿瘤相关基质，而不是作为旁观者；这样的话，这些间质细胞对于特定能力标志的发展和表达是有贡献的。在接下来的十

肿瘤侵袭和转移的恶性生物行为及分子干预

项目名称：肿瘤侵袭和转移的恶性生物行为及分子 干预 首席科学家：詹启敏中国医学科学院肿瘤医院肿瘤 研究所 起止年限：2009.1至2013.8 依托部门：教育部

一、研究内容1．细胞周期调控异常与肿瘤恶性增殖、侵袭相关分子机理 肿瘤是一种“细胞转导通路异常”性疾病,我们将通过分子生物学、细胞生物学、和动物模型相结合的研究技术，重点研究抑癌基因p53、BRCA1、Gadd45介导的信号通路与细胞周期蛋白Aurora-A、Cyclin B1、Plk1的相互作用，以及在细胞周期调控和肿瘤恶性表型形成中的生物学功能和分子机制。从而揭示细胞增殖失调与肿瘤侵袭转移的内在联系。 2．细胞凋亡和分化异常与肿瘤侵袭性生长的关系 细胞凋亡调控机制的异常与侵袭特性生长密切相关。促进细胞死亡的机制失活和抑制凋亡的分子的大量表达使癌症细胞存活延长，使基因突变的积累和癌变机会的增加，同时凋亡机制的异常导致肿瘤细胞具有抗药性。通过对细胞死亡新机制、肿瘤干细胞凋亡相关研究、细胞信号转导与凋亡调控等研究，深入探讨侵袭性生长的机制。 3．肿瘤干细胞和肿瘤微环境与肿瘤转移的内在关系 以恶性肿瘤干细胞特异性表型为突破口，从白血病干细胞延伸至实体瘤干细胞，研究其自我更新和分化的特性，探讨肿瘤转移的起始因素和关键分子生物学性质，认别恶性肿瘤干细胞与微环境或肿瘤“基质”间的相互作用机制,从而为特异性打击肿瘤干细胞作为彻底消除肿瘤转移潜能的一种新策略提供重要的理论基础。 4. 肿瘤血管和淋巴管新生介导的肿瘤转移机制 已鉴定肿瘤组织中血管表达Tim-3和淋巴管表达Sema4c等是沉默抗肿瘤免疫的重要活性分子，能通过与淋巴细胞的对话，诱导机体对肿瘤的免疫耐受，是

细胞凋亡与肿瘤

细胞凋亡与肿瘤 巴桑卓玛 (西藏大学医学院基础医学研究所) 摘　要　细胞凋亡是一种进化保守的细胞死亡形式,不仅在正常的生理状态具有重要作用,而且与多种疾病的发生发展密切相关。近年来研究认为,细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生,是由于细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调的结果,细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用,因此研究抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡而对正常细胞影响不大是肿瘤治疗的新思路。 关键词　细胞凋亡　诱导　治疗　肿瘤 多细胞机体,包括人,均存在着细胞增殖与死亡的平衡,以维持机体的稳态,二者是一个矛盾的两个方面,此矛盾的运动发展推动着机体的生、老、病、死。传统的肿瘤研究者关注的首先是细胞的增殖。肿瘤细胞是永生性细胞,如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力,是他们首先考虑的问题。然而,机体还存在另一普遍现象,即死亡。细胞的死亡有两种形式,一种是病理性死亡,称为坏死(necrosis)。它是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物的侵袭所致的细胞急速死亡。其重要的特点是细胞肿胀、溶解、释放出裂解产物,使周围组织产生炎症反应。另一种是生理性死亡———凋亡(apoptosis)。 1　细胞凋亡与一般的死亡有很大的不同,主要表现以下几个方面 形态学特征:细胞凋亡是细胞在生物体发育过程中,在一定诱导条件下接受指令而发生的程序化事件,是导致最终自我消亡的生命活动。发生时首先是染色质的凝集,嗜碱性染色增强,然后细胞核崩解,此时线粒体保持形态正常,最后细胞体积缩小,一部分细胞质和核碎片进入由膜包被的程序死亡小体,它们从细胞表面出芽脱落,并被组织专职巨噬细胞、上皮细胞吞噬。由于细胞内容物不泄漏,因而没有炎症反应。 生化特征:染色质降解,核小体间连接DNA部位被降解,产生寡聚核小体DNA 片段,即180-200bp整数倍的不同长度的DNA片断。 细胞凋亡的化学信号:在细胞程序死亡时出现快速持续的Ca2+浓度上升。如在胞质钙离子载体tributyrin和抗-CD3抗体诱导的胸腺细胞凋亡中就发现有钙离子浓度升高的现象。研究发现Ca2+增加与A TP一起作用于染色质,使原来折叠的很紧的染色质变松散,露出亲水部分,以便脱氧核糖核酸酶(Dnase)水解。Danson (1993)发现Ca2+可以参与Ca-calmokulin dependent phospatase作用,产生凋亡。Wornonicz提出Ca2+可以直接作用于核内转录因子引起凋亡。另外Ca2+还可活化

肿瘤学研究常用实验技术及方法

精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。

4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题

【9A文】肿瘤的转移机制综述

肿瘤转移的分子机制 陈露12级七临9班12170918 指导老师：马长艳 【摘要】恶性肿瘤是危害人类健康的全球公共卫生问题之一，为新世纪人类的第一杀手。转移是恶性肿瘤发生和演变过程中最危险的阶段，了解恶性肿瘤侵袭、转移发生机制，寻找相应阻断途径对遏制恶性肿瘤发展有重要作用。本文就恶性肿瘤细胞侵袭与转移机制的研究进展作一综述。 【关键词】恶性肿瘤、侵袭、转移机制 众所周知，转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因，大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移[1]。肿瘤的转移过程包括从肿瘤的原发部位脱离，进入周围的基质，进入循环或淋巴系统，粘附在内皮细胞壁并向血管外迁移及在远处侵润，血管增生，形成新的转移灶等。从上个世纪StephenPaget提出肿瘤转移的种子-土壤学说到现在，人类对于肿瘤转移机制的研究已有一百多年历史。随着各种理论的不断完善，人们对于肿瘤转移这一极为复杂的病理过程有了更进一步的认识。肿瘤的转移主要与以下几个因素有关。 1.遗传异质性 实验证实，肿瘤细胞的同一转移性克隆中可以分离出不同恶性潜能的亚克隆，而高转移性克隆出现遗传学突变的频率要远远高于非转移性克隆，提示肿瘤转移是一个主动的过程，与基因组的不稳定性具有早期联系[2]。临床上与肿瘤转移相关的基因分为肿瘤转移促进基因及肿瘤转移抑制基因，如matal、H-ras、nm23、mts-1、WDNM、PGM21等，它们通过参与信号传导，诱导转移表型，调节细胞因子表达来诱导、促进、抑制肿瘤转移，如VaramballR等[3]研究发现EZH2在前列腺癌转移演进的过程中通过异位过表达和重建染色体等组成性抑制多种抑癌基因，并与肿瘤的转移和不良预后密切相关。肿瘤的遗传异质性是肿瘤细胞逃避免疫监视、产生化疗抗性、形成转移复发的根源，是抗转移治疗中不可忽视的重要环节。 2.上皮间充质转化EMT 2.1EMT概念 上皮间质转化(EMT)是指具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程，它以上皮细胞极性的丧失及间质特性的