sephadexg-75凝胶层析法分离蛋白质

Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质

一.实验原理

凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。二.试剂器材

Sephadex G-75粉末

洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl

5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL；

其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等

三.操作步骤

凝胶的制备：

称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；

装柱：

取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；

平衡：

凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；

加样：

称取样品溶解于5mL的洗脱液中。先吸去床面上层多余的洗脱液，余2-

3mm，关闭柱出口，将样品溶液贴着柱的内壁旋转缓慢加入，打开柱出口，让样品渗入凝胶床内；

洗脱：

待液面与床面持平时，先用少量的洗脱液冲洗内壁，再用洗脱液进行洗脱；

收集：

用分部收集器收集洗脱液；

蛋白浓度检测：

用分光光度计以280nm波长紫外光检测各试管溶液的吸光值。

四.注意事项

凝胶的特性要点

葡聚糖G后面的数字代表不同的交联度，数值越大交联度越小，吸水量越大，其数值大致为吸水量的10倍。Sephadex对碱和弱酸稳定(在L盐酸中可以浸泡1-2小时)。在中性时可以高压灭菌。不同型号中又有颗粒粗细之分。颗粒粗的分离效果差，流速快。颗粒越细分离效果越好，但流速也越慢。交联葡聚

糖工作时的pH稳定在2-11的范围内。葡聚糖G型凝胶分离的分子量分级范围为700-8×105。

凝胶的溶胀

G系交联葡聚糖凝胶亲水性强，只能在水中溶胀(仅有少量的有机溶剂也可以使之溶胀)，有机溶剂或含有有机溶剂较多的水溶液会改变其孔隙，使之收缩失去或降低凝胶的分离能力。在水中溶胀时如在室温则需要较长时间，才能达到充分溶胀的程度，但可煮沸到100℃，以缩短其溶胀时间。