蛋白样本制备

培养的细胞（定量）：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶12000g离心，4℃，5min。

⑷将上清转移至另一只EP管中并编号置于冰上检测浓度

⑸取少量上清进行定量。（上清量随细胞量与裂解液量而定接种细胞4*10^5

150ul裂解液则可以取1ul）

1. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。

2. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20 l 25mg/ml蛋白标准，加入980 l 稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20℃长期保存。

3. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100 lBCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定。

4. 各孔加入200u l BCA工作液，

5. 加适当体积样品（上清量随细胞量与裂解液量而定接种细胞4*10^5 150ul裂解液则可以取1ul）到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液（实验用超纯水代替）到20ul。

6.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液（实验用超纯水代替）补足到20u l。37℃放置20-30分钟。

⑹将所有蛋白样品调至等浓度（1.5~3.5ug/ul）保证加样为40ug左右，充分混合沉淀后加5×loading buffer稀释为1×后100℃，5min。直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天。

THERMO 多功能酶标仪

操作

1板进

2孵育37℃（勾选到温度时计时）25min

3振动5s

4暂停5s

5光度测量562nm

布局

样品

结果

定量曲线拟合图片复制粘贴到word保存成图片到桌面

拟合后的结果在excel中打开插入图片保存//e whn名称+日期

删除桌面文件后登记关机