核酸探针技术

核酸探针技术

化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。

核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。

(一) 核酸探针的种类

1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。

作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。

将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。

用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用

2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。

目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性

同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。

(二) 核酸探针的标记

1.放射性同位素标记法常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。

切口平移法(nick translation)是利用大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下：

(1) 取1?g DNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液( 0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL 牛血清白蛋白)，加入除标记物(如?-32 p-dA TP)外的其它三种dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。

(2) 加入100?ci(10?l)标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l,混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l(约5单位)E.coli DNA polymerase I，混匀。

(3) 置14-16℃反应1-2小时。

2.非放射性标记法可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物-光敏生物素(photobiotin)，光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照射下，可与核酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链DNA及RNA的标记，探针可在-20℃下保存8-10个月以上。具体操作方法如下：

(1) 将双链DNA变性或用NaOH处理形成缺口，单链DNA或RNA毋需处理，将核酸样品溶于水。

(2) 暗室下在微量离心管中加入10?g DNA，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混匀。

(3) 冰浴中打开离心管盖，在300-500瓦灯下照射10分钟(液面距灯泡10cm)。

(4) 加入100?l 0.1mol/L Tris－HCl，pH8.0，加入100?l 2-丁醇抽提两次，离心，弃上层。

(5) 乙醇沉淀核酸探针；用70％乙醇漂洗真空抽干，备用。

除上述标记法外，探针的制备和标记还可通过PCR反应直接完成。

(三) 核酸杂交杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或

尼龙膜(nylon membrane)。

固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。

用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。

近年来液相杂交技术有所发展。液相杂交与固相杂交的主要区别是不用纯化或固定的靶分子，探针与靶序列直接在溶液里作用。液相杂交步骤有所简化，杂交速度有所提高，增加了特异性和敏感性，但与临床诊断所要求的特异性和敏感性还有一定的距离。

各种杂交技术中，膜上印迹杂交技术应用最为广泛，它由以下三个基本过程组成。

1.核酸印迹技术

(1) 斑点印迹(Dot-blot)将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h。

应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量。

(2) Southern印迹(Southern blot)这是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。

常规处理如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA 解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。

Southern印迹的操作方法有三种：

①毛细管转移(或虹吸印迹)。这是一传统方法，进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。安放装置时，在转移槽中央的平台上由下到上依次叠放变性凝胶、滤膜、一叠干的吸水纸巾；凝胶与转移缓冲液通过