基因工程药物的制造

二 、反转录-聚合酶链反应（RT-PCR） RT-PCR是将以RNA为模板的cDNA合成同 PCR结合在一起，该法是mRNA经反转录合成 合成目的基因DNA不同部位的两条链的 cDNA第一链，在以随机引物、oligo(dT)或基 寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘 因特异性的引物（GSP）起始协助下，PCR扩 性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片 增，特异性的合成目的cDNA链（目的基因）。 三、化学合成法 段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA 片段，再用连接酶连接成完整的基因。
问题： 来源于真核细胞的产生基因工程药物 的目的基因，为什么不能进行直接分离？
二
基因的表达
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、 翻译以及所有加工过程。
表达系统：
基因工程中用来获得有功能 的异源蛋白质的体系
克隆载体
表达载体
受体细胞（菌）
常用表达载体 -- 质粒pBV220的结构
融合表达质粒pBG-2的结构
三
1. 2. 3. 4. 5.
工程菌的培养
分批培养 补料分批培养 连续培养 透析培养 固定化培养
四
发酵液 细胞分离 胞内产物 细胞破碎 固液分离 包含体 变性 复性
基因工程药物的分离纯化
胞外产物
浓缩
初步分离
高度纯化
制剂
产品
细胞碎片分离
五
基因工程药物的质量控制
一、生物材料的质量控制
二、培养过程的质量控制
第二节 基因工程药物生产的基本过程 （掌握）
基因工程药物制药的主要程序
⒈目的基因的克隆 上游阶段： ⒉构建DNA重组体 ⒊DNA重组体转入宿主菌 ⒋构建工程菌 ⒌工程菌发酵 下游阶段： ⒍表达产物的分离纯化 ⒎产品的检验等
一
一、反转录法
பைடு நூலகம்
目的基因的获得
反转录法就是分离纯化目的基因的RNA， 再反转录成 cDNA，然后进行cDNA克隆表 达。
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：
⑴载体能够独立复制。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源 基因的克 隆鉴定和筛选。
⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能 进行转录。
⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的 mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以 便转录后顺利翻译。
第二章 基因工程制药
回顾：基因工程的基础知识
一、基因的概念: DNA分子中含有特定遗传信息的一段核 苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 二、基因工程技术
是将目的基因插入载体，拼接、转入新的 宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传 物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进 行复制和表达的技术。
三、纯化过程的质量控制 四、目标产品的质量控制 五、产品的保存