单向混合淋巴细胞反应

单向混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction, MLR)

取C57/TLR2 ko /TLR4 ko 小鼠脾脏来源的naive CD4+T细胞作为反应细胞,BALB/c 小鼠骨髓来源的DC作为刺激细胞,建立混合淋巴细胞反应体系,检测该体系中naive CD4+T细胞的增殖能力；分化为TH1/TH17细胞的能力；分泌Th1/Th17细胞因子能力。

反应细胞 naive CD4+ T 细胞的制备

1.断颈椎处死小鼠，70%酒精消毒，固定小鼠于操作台。

2.暴露、分离淋巴结（腹股沟LN、肠系膜LN、腋下LN等）和脾，放至装有C1640

（PBS）的离心管中。

3.碾磨淋巴器官（cell strainer，40um），收集细胞悬液至50ml离心管（200目滤

网过滤），1500rpm，5min。

4.弃上清，加1ml ACK buffer 重悬细胞沉淀，作用30-45sec，加15--20ml C1640

（PBS）稀释，1500rpm，5min。

5.细胞计数。

6.弃上清，200 µl（400µl per 10^8 cells）AutoMACS Buffer重悬。

7.加50µl（100µl per10^8 cells）Biotin-Antibody Cocktail。

8.混匀，至冰上10min-15min（2-8℃5 min）。

9.加150ul （200µl per 10^8 cells）AutoMACS Buffer。

10.加100µl（200µl per 10^8 cells）Anti-Biotin MicroBeads。

11.加50 µl（100µl per10^8 cells）CD44 MicroBeads。

12.混匀，至冰上15min-20min（2-8℃10 min）。

13.加5ml AutoMACS Buffer稀释，1500rpm，5min。

14.弃上清，加3-5ml AutoMACS Buffer重悬，悬液200目滤网过滤，收集细胞悬

液。

15.3-5ml AutoMACS Buffer预先冲洗柱子，细胞悬液过柱，滤液滤尽时加3ml C1640

冲洗柱子，收集滤液至新离心管。

16.加10-20ml C1640（PBS）稀释悬液。细胞计数。

17.1500rpm，5min。弃上清，定容细胞沉淀，调整细胞浓度至1×106/ml。

18.10ug/ml Anti-CD3+、Anti-CD28+ 80ul PBS/wells，96wells，2-4h，37度。

19.弃上清，加细胞悬液100ul/wells。

20.加CK和Ab(Day0）。Th1（IL-12 10ng/ml、Anti-IL-4 10ug/ml），Th2（IL-4 10ng/ml、

Anti-IFN-γ 10ug/ml）,Th17（IL-6 10ng/ml、TGF-β 2ng/ml 、Anti-IFN-γ 10ug/m、Anti-IL-4 10ug/ml），Th17（IL-6 10ng/ml、TGF-β 2ng/ml、Anti-IFN-γ 10ug/m、Anti-IL-4 10ug/ml、Anti-IL-2 10ug/ml），Treg（IL-2 100u/ml、TGF-β10ng/ml、Anti-IFN-γ 10ug/m、Anti-IL-4 10ug/ml）

21.Day3、5，加CK刺激剂（PMA+ Ionomycin +高尔基抑制剂），2-4h，37℃。

22.1500rpm，5min，弃上清，

23.加入预冷PBS洗涤，1500rpm，5min，弃上清，

24.加80ul Fix/perm buffer/wells，4℃，20min。

25.1500rpm，5min，弃上清，加100ul 1X perm buffer/wells。1500rpm，5min，

弃上清

26.加100ul混有抗体的1X perm buffer（Th0、Th1：Anti-IFN-γ;

Th2:Anti-IL-13;Th17：Anti-IL-17; Treg：Foxp3），1h，4℃，加入100ul 1X perm buffer。

27.1500rpm，5min，弃上清，加200ul 1X perm buffer。

28.1500rpm，5min，弃上清，加200ul 0.5%BSA-PBS.

29.上机检测。

细胞增殖染色和混合淋巴细胞培养，接上19步。

20．每107个细胞中加入1μl/ml(4.5mM)CFSE,37度避光孵育15min标记细胞;


21.终止染色,PBS 洗 3 次,含10% FBS 的完全培养基重悬细胞,调整浓度。

2. 刺激细胞的制备
(1)BALB/c 小鼠BMDC 的培养如实验方法六;


(2)用终浓度为40 μg/ml的丝裂霉素C (Mitomycin C,MMC)处理BMDC,37度避光孵育30 min,抑制BMDC 的增殖能力;


(3)PBS 洗 3 次,含10% FBS 的完全培养基重悬细胞,调整浓度。

3. 混合淋巴细胞培养将上述反应细胞与刺激细胞按4:1 比例转入24 孔板,5% CO2, 37°C孵育 5 天。FACS 检测CFSE 标记的T 细胞的增殖能力,TH1,TH17。收集细胞培养上清,ELISA 检测T 细胞分泌IL-17 和IFN-γ 水平。

小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow derived dentritic cell, BMDC)的培养

(1)颈椎脱位处死BALB/c小鼠,75%酒精浸泡5-10 min;

(2)用剪刀在小鼠脚踝部剪开下肢皮肤,并沿一纵行切口剪至大腿根部。用无菌纱布分离肌肉、筋膜等组织,暴露股骨及胫骨。将左右两肢四段骨头放入盛有75%酒精的平皿中,浸泡5min;

(3)在PBS 平皿中用镊子彻底剔除骨干上附着的组织,洗涤 2 次;

(4)用剪刀剪去骨头两端,用1 ml注射器快速将骨髓冲出至PBS中;

(5)1500 rpm离心5 min;


(6)弃去上清,加入1-2 ml红细胞裂解液重悬细胞,室温放置1-2 min裂解红细胞;

(7)加入10 ml P BS 中和,1500 rp m 离心 5 min;


(8)PBS 洗两次,离心后用 1 ml 含10% FBS 的1640 完全培养基重悬细胞,计数。

(9)调整细胞浓度为5×105/ml,铺至24孔板内培养。每孔1 ml细胞,同时加入

GM-CSF(10 ng/ml)和IL-4(5 ng/ml),此时为培养的第1 天;

(10)培养的第3天、第5天,细胞半量更换新鲜培养基,并补充全量的GM-CSF 及

IL-4 细胞因子;


(11)培养的第7 天,收集细胞,流式检测或进行后续实验。