【CN109880843A】一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的间接ELISA试剂盒【
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910237177.6
(22)申请日 2019.03.27
(83)生物保藏信息
CCTCC NO：M2018858 2018.12.05
(71)申请人 扬州大学
地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号
(72)发明人 张小荣 钱炳旭 吴艳涛 郭梦娇
张成成 曹永忠 陈杨
(74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207
代理人 卢亚丽
(51)Int.Cl.
C12N 15/70(2006.01)
C07K 14/165(2006.01)
C07K 1/22(2006.01)
G01N 33/68(2006.01)
G01N 33/569(2006.01) (54)发明名称
一种猪德尔塔冠状病毒抗原制备方法及利
用该抗原制备的间接ELISA试剂盒
(57)摘要
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一
种猪德尔塔冠状病毒PDCoV抗原制备方法及利用
该抗原制备的间接ELISA试剂盒。该抗原的制备
方法是：选取猪德尔塔冠状病毒N基因796～
1026nt核苷酸区域，按照大肠杆菌密码子使用偏
嗜性对该核苷酸区域进行优化设计，优化的基因
片段如Seq No.2，优化片段克隆入pET -32a(+)载
体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效可溶性表
达，进而通过Ni -NTA亲和层析方法进行纯化而获
得。本发明确保了重组蛋白在大肠杆菌表达系统
中表达效率更高，更有利于形成可溶性表达产
物。制备的间接ELISA试剂盒更适用于PDCoV感染
流行病学调查中对猪群进行群体性高通量筛查。权利要求书1页 说明书5页序列表1页 附图3页CN 109880843 A 2019.06.14
C N 109880843
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109880843 A
1.一种猪德尔塔冠状病毒抗原的制备方法，是选取猪德尔塔冠状病毒N基因796～1026nt核苷酸区域，按照大肠杆菌密码子使用偏嗜性对该核苷酸区域进行优化设计，优化的基因片段如Seq No.2，优化的基因片段克隆入pET-32a(+)载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效可溶性表达，进而通过Ni-NTA亲和层析方法进行纯化而获得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤是：
(1)PDCoV N蛋白优势抗原编码区的优化设计与合成，选取PDCoV CHN/Tianjin/2016株N基因序列的优势抗原编码区Seq No.1，根据大肠杆菌密码子使用的偏嗜性规律，对该基因片段进行密码子优化设计，基因片段两端分别加上BamH I和Xho I限制性内切酶识别位点，优化的基因片段如Seq No.2；
(2)重组表达质粒的构建：利用限制性内切酶BamH I和Xho I，将人工合成的N基因片段Seq No.2定向克隆入pET-32a(+)载体相应位点之间，获得重组表达载体pET-32a-PDCoV-N，将重组表达载体进一步转化到BL21(DE3)感受态细胞，获得的重组菌命名为BL21(DE3)/ pET-32a-PDCoV-N，
(3)N蛋白的表达：将对数生长期的重组菌BL21(DE3)/pET-32a-PDCoV-N以1:100的比例接种于添加氨苄青霉素的液体LB培养基中，250r/min剧烈震荡培养至菌液OD600nm在0.4～0.6之间，在不同浓度的IPTG和不同的诱导时间条件下进行诱导表达条件的优化；诱导完成后离心收集细菌，PBSpH7.2洗涤2次后用PBSpH7.2重悬菌体沉淀，然后用超声裂解仪进行破碎，离心后分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白的最佳可溶性表达条件。
(4)包被用N蛋白的纯化：采用上述确定的最佳诱导表达条件进行重组菌的诱导表达，经超声裂解仪进行破碎后将包含可溶性融合表达蛋白产物His-N的重组菌裂解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化后得到猪德尔塔冠状病毒抗原。
3.一种检测猪德尔塔冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，包括包被有猪德尔塔冠状病毒抗原的酶标板、阳性和阴性对照、HRP标记的兔抗猪二抗、样品稀释液、显色液以及洗涤液。
4.如权利要求3所述的检测猪德尔塔冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述的猪德尔塔冠状病毒抗原，通过以下步骤得到：是选取猪德尔塔冠状病毒N基因796～1026nt核苷酸区域，按照大肠杆菌密码子使用偏嗜性对该核苷酸区域进行优化设计，优化的基因片段如Seq No.2，优化的基因片段克隆入pET-32a(+)载体并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效可溶性表达，进而通过Ni-NTA亲和层析方法进行纯化而获得。
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