同工酶凝胶电泳

同台两组共用一电泳槽。 注入两玻璃夹缝中，胶面上加1cm蒸馏水（自 然凝胶后倾出）。
本次实验涉及： 酯酶（Est）: 催化酯类化合物水解的酶系. 催化乳酸脱氢反应的酶.
乳酸脱氢酶(LDH):
过氧化物酶（PO）：催化过氧化物水解 应用： 1) 遗传育种 2）基因定位 ……
同工酶分析的过程
材料的采集 低温研磨、酶提取 凝胶制备 酶的保存
5~10min）
8.
脱色、固定、保存：染色后的胶置于7%乙酸。
标记好组名，交给老师用于照相、保存。
实验报告（在记录本上做）：
目的、原理@、材料、步骤、结果（画图，填下表）、 分析
样品 带数 图谱（由近及远） 表示出宽窄、染色深浅 颜色 迁移距离 迁移率
活性电泳
催化底物水解，染料复合显色
酶谱的记录与分析
带的位置，酶分子量差异、带的颜色深浅(反映酶的活性)
LDH染色原理
乳酸 LDH 丙酮酸 NADH NAD+ NBT(黄) PMS（氢递体） NBTH(蓝紫)
Est染色原理
酯的水解产物与偶氮化合物（如坚牢蓝RR盐）结合 产生红褐色物质．
PO染色原理
H2O2被PO水解，此过程中染料联苯胺显色（蓝褐 色）．
3． 样品制备：酶液10μL与上样缓冲液10μL （1:1）混匀 4． 加样：小心地向每个上样孔加入20μL的样品。
5． 电泳：4℃冰箱中，100v。
（ 接近完成时配染色液！）
6. 停止电泳: 指示剂溴酚兰移至底部约0.5cm时，切断电源。
7. 染色：小心从玻璃板中取下胶。去掉浓缩胶，将分离胶进 行染色至酶带显色。 （避光，Est、LDH约20 min；PO约
要求自配[都做Est。7种样品点完剩余的3孔点普通果蝇、
大果蝇、其他，用于LDH（背讲台组）、PO（面讲台组）：
7. 染色液
(电泳即将结束时配制完成) 配制、染色要避光 Est染液（第一桌配，240mL，均分给各组(30mL×8)） 醋酸а-萘酯 240mg→溶于12 mL丙酮中
监牢蓝RR盐 240mg →溶于12 mL丙酮中→加216 mLpH7.0磷酸缓冲液* 两者完全溶解后把前者倒入后者中，迅速搅拌均匀， 避光过滤。 *pH7.0磷酸缓冲液（250mL）：10.9g Na2HPO4 溶于 152.5mL 水中，3.0g NaH2PO4溶于97.5mL 水中，二者混匀。
2. 4%浓缩胶的配制（两组公用量）
双蒸水/mL 6.2 mL
0.5mol/LTris· HCl（pH6.8）/mL
Acr/Bis（30%）/mL
2.5 mL
3 mL
TEMED/μL
10%Aps/μL 总体积/mL
20 μL
50 μL 10 mL
加入两玻璃夹缝中，并在两玻璃板夹缝中 水平插入梳子，待凝胶后小心拔出梳子（在缓冲 液中拔梳子）。
专一底物和特殊染料染色进行分析。
为节省时间，先做：架好胶板
电泳原理介绍 教师分头指导操作
配制分离胶（7.5%）（两组的量）：
双蒸水/mL 1.5mol/LTris· HCl（pH8.8）/mL Acr/Bis（30%）/mL TEMED/μL 10%Aps/μL 总体积/mL
9 mL 5 mL 5 mL 20 μL 100 μL 20 mL
实验0X 果蝇变异的遗传标记实验—— 同工酶凝胶电泳
（教材实验18， p85-89）
一、实验目的：
掌握同工酶分析的方法技术 理解同工酶分析的遗传学意义
助教：
郑莹
二、主要实验内容：
凝胶制备→提取酶液→活性电泳→染色分析
三、实验原理：
同工酶（isozymes）是指催化反应相同，但结构和理化性 质不同的一族酶。是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。 利用电泳分离（根据分子量、电荷）
+400μL匀浆缓冲液匀浆
（冰浴操作）
用于同工 酶实验 匀浆液200μL 液体倒入1.5ml离心管 用于RAPD实 验提取DNA 液体倒入1.5ml离心管 匀浆液200μL
4℃，10000rpm， 10分钟
+22μL SDS、2μL的 蛋白酶K
移上清于另一离心管，4℃保存。
翻转混匀（动作要轻） →55℃水浴 >2h →存-20℃
染色约20分钟。
PO染液[第3桌配，60mL]
联苯胺 冰乙酸
1.0 g 9.0 mL
溶，可研磨
水
A液
36 mL
5.4 mL 0.6mL
A液
30% H2O2 水 54mL
混合成为染色液
染色5~10分钟，水洗停止反应。
五、方法步骤（合理分工、协调时间）
1. 提取酶液
每份材料（普通果蝇40只、大果Fra Baidu bibliotek10只、或其他材料0.2g）
PO染色 示意
LDH5
LDH电泳 结果实例
LDH4 LDH3 LDH2 LDH1
四、实验材料：
1份（7种果蝇样品+1种其他）/小组
（1）D.Virilis ------------10只 （2）黑腹果蝇--P♀、P♂、 F1♀、F1♂、 F2♀、 F2♂各40只 （3）其他材料 -- 0.2g （1）、（2）的P、（3）由教师提 供，（2）F1、F2用自己存的材料。
染色约20分钟。
LDH染液[第2桌配，60mL]: NAD+ 30.0 mg NBT（氯化硝基四氮唑蓝） 18.0 mg PMS（吩嗪二甲酯硫酸盐） 1.2 mg 乳酸钠 0.7g 0.5 mol/L Tris· Cl （pH7.1） 4.4 mL （老师提供）
0.02 g NaCl
蒸馏水 55.6mL
已配制的各种试剂：
1. 组织匀浆液： 100mmol/L NaCl-10mmol/L Tris· HCl （pH8.0）-25mmol/L EDTA （pH8.0） 1). 5mol/L NaCl 2). 0.5mol/L Tris· HCl pH8.0 3). 0.5mol/L EDTA pH8.0 2. 1.5mol/L Tris· HCl pH8.8（4℃存放） 3. 0.5mol/L Tris· HCl pH6.8（4℃存放） 4. 30%Acr/Bis ： 29.2gAcr+0.8gBis→双蒸水定容至 100mL→过滤→4℃存放 5. 上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝-40%（W/V）蔗糖水溶液 6. 电泳缓冲液（室温）： 5×： Tris7.5g + Gly 36g→双蒸水 溶解定容至500mL。使用时稀释至1 ×——老师配好。