开菲尔中菌种分离与鉴定方法初探

1.4.4.1 吲哚实验
菌8株
将选取的菌株接种到蛋白胨液体培养基中 36±1
2.2 初筛结果
培养 48h 在各管中加入乙醚 0.5–1ml 静置 5min
对 81 支菌株分别做 6 种糖发酵实验 发酵结果
然后沿管壁缓缓加入数滴吲哚显色剂 不可振荡试 以 3 个平行中的多数为准 剔除掉以下 3 类菌株 1
１ 材料与方法
1.1 实验材料 开菲尔粒 本食品科院微生物实验室提供 无抗生素鲜牛奶 湖南农业大学奶牛场购得
1.2 培养基[4] 1 糖发酵培养基 蛋白胨 2.0g NaCl15.0g
KH2PO40.2g 1%溴麝香草酚蓝水溶液 3ml pH7.6–6 蓝色 —黄色 糖 分别加入葡萄糖 蔗糖 乳糖 淀粉 甘露醇 糊精组成六种糖发酵培养基 10.0g 加蒸馏水至 1000ml pH7.0–7.4
MR 实验
+
VP 实验
+
+
+
规范的条件下制备开菲尔粒 然后在高度无菌的条件 下 至少做 12 种以上的糖发酵实验 才能得到满意的
注
为阳性反应
为阴性反应
分离结果
2 号球菌的糖发酵实验 表 1 生理生化实验 表 2 其基本特征与手册中肠球菌属坚强肠球菌特征完 全相同 初步鉴定为肠球菌属坚强肠球菌种
11 号杆菌的糖发酵实验 表 1 生理生化实验
否则为阴性
号球菌 11 号杆菌 12 号球菌 表 2 根据这几个
1.4.5 菌种鉴定
菌株的个体形态 培养特征及各主要生理生化实验结
根据糖发酵试验结果 生化试验结果 结合菌株
果查参考文献[5 6 7]鉴定菌种
的个体形态和菌落形态参照文献[1,2,3]对选择出来的菌
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10 短杆菌 + ^ + ^ + ^
11 短杆菌 +
+
12 球菌 +
+^
13 球菌 + ^ + ^ +
14 球菌 + ^ + ^ +
甘露醇
d d d
d d
^ d +
乳糖 +^ + + d d
^ d
^
淀粉 +
菌数 然后分别在 10 45 下培养 24h,计数 若前
15 球菌 + ^ + ^ d
后两次计数差别不大 则为阳性 否则为阴性
全相同 初步鉴定为乳杆菌属干酪乳杆菌
Ladodo KS. Effect of different types of feeds for newborn
12 号球菌的糖发酵实验 表 1 生理生化实验 表 2 其基本特征与手册中肠球菌属假鸟肠球菌种 完全相同 初步鉴定为肠球菌属假鸟肠球菌种
infants on intestinal microbiocenosis[J]. Vopr Pitan. 1979 ,6: 49- 53. [3] 夏菠,张庆等.开菲尔粒及其发酵液中菌相分析[J].食品与
Abstract: Kefir is fermented by many kinds of lactobacillus and yeasts. This experiment separated and cultivated several microbes in Kefir. According to their main characters, results of sugar fermentation and results of physiology and chemistry of bacterium, we identified 3 microbes.
将甲基红指示剂加入已培养好的 V P 实验培养 液中观察其变化 培养液变黄色为阴性 培养液呈红 色不变为阳性 1.4.4.4 硫化氢实验
将被试菌穿刺接种到硫化氢培养基中经 36±1 48h 培养后观察 若有硫化氢产生 则出现黑色 1.4.4.5 明胶液化
挑取 18~24h 待试菌培养物 以较大量穿刺接种 于明胶高层约 2/3 深度 于 20~22 培养 24h 不摇动 静置冰箱中待其凝固后 再观察其是否被细菌液化 如确被液化 即为试验阳性 1.4.4.6 温度适应性
注
为阳性反应
为阴性反应 ｄ 为反映不明显
1.4.4.7 耐盐性
＾ 为产气
将待测菌稀释到一定程度 用稀释平板法测定其 2.3 复筛结果
菌数 然后在稀释液中加入 6.5 的 NaCl, 20~22 培
对初筛出来的 15 支菌株进行生理生化实验 剔
养 24h,计数 若前后两次计数差别不大 则为阳性
除反应相同的菌株 得到 3 株不同的菌种 分别为 2
[7] 7.R.E.布坎南,伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)[M].北京:科学 出版社 1984: 797-822
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开菲尔中菌种分离与鉴定方法初探
作者： 作者单位：
Vol.21 No.4(总 86)
表 ２ 生理生化实验结果
菲尔奶所固有的风味
Table 2 the result of physiology and chemistry tests
3.2 在分离鉴定中菌种漏检的原因分析
实验项目
2 号球菌 12 号球菌 11 号杆菌
明胶液化实验
开菲尔粒是在牛奶自然发酵中形成的多种微生 物的共生体系 由于培养条件不完全一样 会产生一
关键词 开菲尔 分离 鉴定
To Explore the Separation and Identification of Bacteria in Kefir
Xia Bo, Zhou Chuan-yun, Zhang Qing Luo Yang Tang Shu-fen College of Food Science and Technology of Hunan Agriculture University , Changsha 410128, China
2 蛋白胨液体培养基 吲哚试验用 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 加水至 1000ml pH7.2–7.4
3 萄萄糖蛋白胨培养基 V.P 及 M.R 试验用 蛋白胨 5.0 g 葡萄糖 5.0 g NaCl 5.0 g 加水至 1000ml pH7.2–7.4
4 柠檬酸铁铵培养基 产硫化氢实验用 柠
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开菲尔中菌种分离与鉴定方法初探
夏菠，周传云，张庆，罗阳，唐淑芬 （湖南农业大学食品科技学院 湖南长沙 ４１０１２８）
摘要 开菲尔乳是由数种乳酸菌及酵母菌共同发酵而得 本实验对开菲尔发酵液 即开菲尔乳 中的各种微生物进行了分离培 养 依据其个体特征 糖发酵实验以及生理生化实验结果 筛选出 ３ 支菌株 对照乳酸菌 酵母菌 细菌分类鉴定表 确定此 ３ 支菌 分别为 肠球菌属坚强肠球菌种 肠球菌属假鸟肠球菌种 乳杆菌属干酪乳杆菌
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檬酸铁铵 棕色 0.5g Na2S2O3 0.5g 牛肉膏蛋白 胨琼脂 1.5% 培养基 1000ml pH7.4 121ºC 灭菌 20min 搁成直立柱 1.3 主要仪器设备
超净工作台 压力蒸汽消毒器 电子天平 pH 计 显微镜 恒温培养箱 常规玻璃皿 1.4 实验方法 1.4.1 开菲尔发酵液的制备
管 如试管中有吲哚产生 则在乙醚层出现玫瑰红色
不发酵乳糖的菌株 2 在培养液表面产生薄膜的菌
即呈阳性反应 以“+”表示
株 3 产生芽孢的菌株 在 81 个菌株中 6 个糖发酵
1.4.4.2 V P 实验
实验结果相同的菌株 视同一种菌株 只选取其中一
将选取的菌株接种到葡萄糖蛋白胨培养基中
株进行下一步的复筛 表 1 为 15 种糖发酵实验选择出
10ºC 生长实验
+
+
45ºC 生长实验
+
+
+
耐盐实验
+
H2S 实验
+
吲哚实验
些变形菌 也易被杂菌污染 因此初筛时菌种太多 有时分离反应现象不明显 给分类鉴定带来一定困难 一些菌种在一些不明显的反应试管中被排除了 如酵 母菌应该在开菲尔乳中存在 但本次实验未能检出 因此 要对开菲尔乳的菌种进行精确鉴定 首先要在
参考文献
[1] Koroleva NS.Technology of kefir and kumys[J]. IDF Bull. 1988,227: 96-100.
表 2 其基本特征与手册中乳杆菌属干酪乳杆菌完
[2] Goncharova GI, Semenova LP, Kozlova EP, Lyannaya AM,
36±1 培养 24~48h 取培养液约 2ml 入洁净试管 的菌株
中 加 2ml 氢氧化钠 40% 再用牙签挑少量肌酸 约
表 １ 糖发酵实验结果
0.5~1mg 加入各管中 然后激烈振荡试管以保持良
Table 1 The result of sugar fermentation
好通气 经 15~30min 后 若培养液呈红色者为阳性 反应 1.4.4.3 M.R 实验
将待测菌稀释到一定程度 用稀释平板法测定其
序号
形态特 征
葡萄糖
糊精
蔗糖
1 球菌 + ^ + ^ + 2 球菌 + ^ + ^
3 酵母 + ^ + ^ + ^
4 酵母 + ^ + ^ + ^
5 球菌 + ^ + ^ + ^
6 酵母 +
+
7 酵母 +
++
8 酵母 + ^ + + ^
9 酵母 + ^ + + ^
将开菲尔粒按照 1:50 的比例 加入灭菌鲜牛奶 中 在 25ºC 下培养 24h 过滤分离出初次活化的开菲 尔粒 加入到新灭菌奶中继续培养 24h 如此连续活 化 3 次 取最后一次发酵液以备实验用 1.4.2 菌种的分离
吸取开菲尔发酵液 25ml 放入含有 225ml 灭菌生 理盐水及有玻璃珠的三角瓶内 摇匀后制成稀释 10 倍的开菲尔发酵液 再利用无菌生理盐水试管对其进 行 10 倍递增稀释 直至稀释度达到 10-14 吸取最后 的稀释液分别在 MRS 培养基 乳酸菌选择培养基 PDA 培养基 酵母菌选择培养基 ELLIKER 琼脂培 养基 醋酸菌选择培养基 上均匀涂布 各设 2 个重 复 置于 25ºC下培养 72h 然后挑取三种培养基上的 所有优势菌落 分别移入相应的斜面培养基上进行培 养 培养好后 低温保藏 并对所有菌株进行染色镜 检观察 以确定菌株个体形态 1.4.3 菌种初筛
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在每个保藏菌株的试管中各取一环菌体 接入已 种进行鉴定
经配制好的上叙 1.13 中的 6 种糖发酵培养基中 每种 糖做 3 个平行发酵管 35ºC培养 18–24h 根据糖发酵
２ 源自文库结果与分析
业出版社,1999:1-118.
最佳发酵温度为 28ºC 其凝乳时间大概 10 小时 将
[6] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979:
这三株菌混合后进行发酵制备仿开菲尔奶 经过感官
103-117.
评定发现 仿开菲尔奶凝固效果很好 味甜 没有原 开菲尔奶所固有的酒精和碳酸味道 由于在分离鉴定 过程中 本实验漏检个别菌株 因此无法制备出原开
实验的结果 按照择优原则选取优势菌株
2.1 菌株分离结果
1.4.4 菌种复筛
从开菲尔发酵液中分离得到 81 株菌 经染色镜
将选取的菌株接种到不同的生理生化培养基中 每 检后得知其中个体形态为短杆状的共 17 株 长杆状
个处理设 3 个平行实验管
含芽孢 10 株 球状菌 30 株 酵母菌 16 株 产膜
３ 分离与鉴定方法讨论
机械,2004.6:13-14. [4] 祖若夫 胡宝龙 周得庆.微生物学实验教程[M]. 上海:
3.1 分离菌种制备开菲尔的实验 本实验从开菲尔发酵液中分离与鉴定出 3 株菌
对这三株菌分别进行凝乳实验 他们在 6.5%加糖量下
复旦大学出版社,1993: 222-234 [5] 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工
Keywords: Kefir; Separation; Identification
开菲尔是一种多功能的保健性饮料 对于代谢混 乱 动脉硬化 过敏性等病症均有疗效[1] 有证据表 明高加索地区的人们普遍长寿是因为开菲尔的功劳 开菲尔尤其对于人类的消化功能有很大益处[2] 为了 研究开菲尔乳的大规模 标准化生产工艺 制备发酵 纯菌种及工业发酵用的开菲尔发酵剂成为技术开发的 关键 本研究在开菲尔乳菌相分析的基础上[3] 对分 离的主要菌种进行了鉴定