实验三 单向琼脂扩散实验

单向琼脂扩散试验
实验方法
标准曲线的制备
1．制作琼脂板所需要的1.5%离子琼脂，首先分 装其1/2量的3%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中 平衡温度备用。 2．稀释抗体，用pH7.4的PBS稀释标准抗人IgG抗 体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应 与3%盐水琼脂量相等。 3．制备琼脂板：将已稀释的抗人IgG抗体于56℃ 水浴中预热，再倾注于已溶化并维持56℃的3%盐 水琼脂中混匀，取5ml即刻倾注于玻片上，待凝 固后即可。 4．打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上 用打孔器打孔4个，孔距10mm。
单向琼脂扩散试验
实验方法
人血清中IgG正常值的测定： 1．将已制备好的抗体琼脂板置于打孔 模板上，每一琼脂板可打孔2个。 2．取正常人血清，用PBS做1:4稀释。 3.用微量加样器分别取稀释后人血清 标本10µl加入孔中，每份各加两孔。 4.作好标记放湿盒中，置37℃温箱， 24小时后观察结果。
了沉淀线，时间太长会造成沉淀线的扩散。
单向琼脂扩散实验
江南大学微生物与免疫学实验室
教学对象：强化班学生
实验课时：3学时
课程类型：专业实验课 课程要求：必修
每组人数：4人
实验目的与要求
掌握单向琼脂扩散试验的原理、结果分
析及应用
单向琼脂扩散试验
实验原理：
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔， 在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状
Fra Baidu bibliotek
低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性；
加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确
保每孔的液面基本一致；
加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不
好观察；
加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备； 孵育时间应控制在24~48小时，时间太短可能产生不
扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原或 国际参考蛋白制成标准曲线，从标准曲线上，可以查 出待检样品中抗原的含量。本试验主要用于检测标本 中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏 感性很高。
单向琼脂扩散试验
试剂与器材
羊抗人IgG血清 待检人血清 标准参考血清 pH7.4 0.01M PBS缓冲液 琼脂粉 载玻片、打孔器、 37℃恒温箱、湿盒、可调微量加样器等；
单向琼脂扩散试验
实验方法
标准曲线的制备
5．用PBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白：浓度分 别为800mg/L、400mg/L、200mg/L、100mg/L。 6．加样：将已稀释的不同浓度的工作标准蛋白依次用微 量加样器每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换 塑料吸头）。 7．将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观 察结果。 8．用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为 纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制 成标准曲线。
单向琼脂扩散试验
结果计算
分别量取各孔样品沉淀环的直径，根 据提供的参考标准曲线，计算待检血 清中各种免疫球蛋白的含量 成人血清中IgG范围 700~1660mg/L
单向琼脂扩散试验
实验结果
单向琼脂扩散试验
实验结果
单向琼脂扩散试验
注意事项：
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太