第四章 基因克隆的酶学基础2014概论

(2)、 限制性内切酶产生的末端
粘性末端Cohesive ends (Mached ends)
5‘粘性末端, 3’突出末端
平末端 Blunt ends 非对称突出端
①粘性末端Cohesive ends (Mached ends)
DNA分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单链 延伸末端结构,能够通过互补碱基的配对而重新连接起来.
EcoRI 37 ℃
5‘ … G-C-T-G-OH
P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
OH-G-C-T-C … 5’
退火 4-7 ℃
OH P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’
寄主的限制与修饰的作用
保护自身的DNA不受限制; 破坏外源DNA,使之迅速降解
2.限制酶的发现
60年代提出了限制性内切酶和限制酶的概念 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶
有特定的识别位点但没有特定的切割位点，切割位点离识 别位点达 1000bp 以上。
1970 年 ，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith找到 HindⅡ 限制性内切酶 。
① II型核酸内切限制酶 ② DNA连接酶 ③ 大肠杆菌DNA 聚合酶 ④ 反转录酶 ⑤ 多核苷酸激酶 ⑥ 末端转移酶
⑦ 核酸外切酶III
⑧ λ核酸外切酶 ⑨ 碱性磷酸酶 ⑩ S1核酸酶 Bal31核酸酶 TaqDNA聚合酶
DNA的一级结构 DNA的二维结构
核酸酶
通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷 酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生 水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。
第一节、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切
割
1. 寄主控制的限制与修饰现象(R/M)
（Restriction and modification）
EcoB
EcoK
修饰的甲基转移酶 核酸内切限制酶
E.coli 菌株 E.coli K
λ噬菌体感染率
K
B
C
1
10-4
10-4
E.coli B
10-4
1
10-4
专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶 （RNase) ；特异水解断裂DNA分子的则 叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。
从核酸分子末端开始,一个核苷酸一个核 苷酸地消化降解多核苷酸链,称为核酸外 切酶（ exonuclease）；从核酸内部切割 磷酸二酯键使之断裂为小片段的为核酸内 切酶（endonuclease）。
基因工程——DNA重组技术的艺 术
第四章 分子克隆的酶学基础
基因的重组与分离，涉及到一系列相互关 联的酶促反应。特别是核酸限制性内切酶 和 DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的 体外连接与切割成为可能。
核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组 DNA技术赖以创立的重要酶学基础。
重组DNA实验中常使用的酶
实际上要少一些，如Bgl II只有6个，BamHI只有5个， 而SalI只有2个。
基因组中碱基对的排列是非均匀的 ，尽管有的酶 切序列中 GC 含量相同，但在基因组中出现的
机率还是不一样。
在 E.coli 中
AsoⅠ（GGCGCGCC） NotⅠ（GCGGCCGC）
会少来构建图谱）
EcoRⅠ 和 HindⅢ SpeⅠ（ACTAGT）
E.coli C
1
1
1
说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA
EcoR I
GAATTC CTTAAG
M EcoR I
限制作用
G3’ 5’ AATTC CTTAA5’ 3’ G
EcoR I
修饰作用
Me GAATTC CTTAAG
Me
核酸内切限制酶EcoR I 及其修饰的甲基化酶MEcoR 的限制与修饰作用
II型酶
单一成分 Mg2+
III型酶
2种不同亚基 ATP, Mg2+, S-Met
序列特异切割
切割位点
不是
距识别序列1kb 处
随机切割
是
识别序列内 或附近
是
距识别距离下游 24-26bp处
克隆中的作用
无用
十分有用
用处不大
4. II型核酸内切限制酶的基本特性
(1) 基本特性
① 在特异识别序列切割DNA分子； ② 两个单链切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相对； ③ 断片往往具有互补的单链延伸末端。
a .在对称轴的5’一侧切割底物， DNA双链交错断开，形成5‘突出末端
5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
EcoRI切割位点
EcoRI等产生的5‘粘性末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’
识别序列
4-8个核苷酸序列
①大部分呈旋转对称、反向重复结构—回文结构
切割位点
C-C-G-C-G-G G-G-C-G-C-C
切割位点 对称轴
A B C C΄ B΄ A΄ A΄B΄ C΄ C B A
A B B΄ A΄ A΄ B΄ A B
② 部分识别序列不对称:
AccBSⅠ :CCG↓CTC GGC↑GAG
BssSⅠ : C↓TCGTG GAGCA↑C
③ 有一些限制酶可识别多种序列 AccI GT MKAC (M:A或C)
HindII GTY RAC(Y:C或R:A或G)
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
识别位点在DNA分子中的频率
假定核苷酸随机排列的情况下进行
44=256 46=4096
实践中: 如λ DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，
2006年2月为止共发现3773种限制酶,810种 甲基化酶
核酸内切限制酶 (restriction endonuclease)
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定 核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA 双链的核酸内切酶
3. 核酸内切限制酶的类型
特性
蛋白质结构 辅助因子
I型酶
3种亚基 ATP, Mg2+, S-Met
20kb 200kb （常利用它出现的机
5kb 60kb
细菌基因组（Bacteria genome) 大多数富含A+T的细菌中，CCC和CGG的排列 是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列 出现的几率就非常少。 酵母基因组（Yeast genome) G+C含量38%， 在重复序列之外，富含G+C 的识别序列就特别少。 哺乳动物中含CG序列的酶切位点稀少，大多CG序列 是甲基化的