第三章 基因工程的酶学基础

BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点（hybrid site）
由一对同尾酶分别
产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点 ： GATC C （ BamHⅠ ）
CTAG T（ BclⅠ ）
用途： 1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’ 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’OH末端。 2. 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’末端： 生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生 物素蛋白结合物的接受位点。 3. 用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸， 从而形成粘性末端。
Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并 在这一顺序的3’端24~26bp处切开 ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没 有特异性的。
Ⅱ型酶的基本特性
1. 在DNA双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。 2. 两个单链断裂部位在DNA分子上的分 布，通常不是彼此直接相对的 3. 因此，断裂的结果形成的DNA片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） 该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由 Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用 的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二 脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合 起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退 火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以 进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。
限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互 补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连 接起来。 分子内的连接：由同一片断的两个互补 末端之间的碱基配对而形成的环形分子。
限制酶的特性
a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关； b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限 制酶只具一个限制位点的质粒）。
碱性磷酸酶： 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA （RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH， 该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同 位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环 化）时可进行脱磷酸反应。
基因工程的酶学基础

限制性核酸内切酶 ＤＮＡ连接酶 DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease）
这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内 切酶。
寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象：
3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化 作用
小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的se） 与分子的体外连接
末端核苷酸转移酶（terminal transferase）
该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它是从小牛胸腺 中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二 甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行 5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分 子加到线性DNA分子的3’-OH末端。 它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ 片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。 它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA, 也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA
S1核酸酶： 来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链 DNA，用于将粘性末端水解成平末端及 cDNA发夹式结构的处理。 反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以 RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常 用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV） 反转录酶两种。
同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的 粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割 位点的选择余地更大。 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
• 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专 门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是 避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染， 是细胞中的一种防御机制。由于R/M现 象的发现使得核酸内切酶成为基因工程 重要的工具酶。 • 根据酶的功能、大小和反应条件，及切 割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶 分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
核酸内切限制酶标准的缓冲液 1. 氯化镁、氯化钠或氯化钾：
不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性， 还可能导致识别序列的改变。
2. Tris-HCl ：
维持最适的pH值（ pH ＝7.4）。
3. β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ： 维持酶的稳定性。 4. 牛血清蛋白（BSA） ：维持酶的稳定性。
Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和 E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫 氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别 位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机 的，所以在基因工程中应用不大。
Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜 血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量较小（105Da），只有一种多肽， 通常以同源二聚体的形式存在。反应只需 Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这 类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 • 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位 点也在这一回文对称结构上。 • 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形 成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。
平末端DNA片断的连接 1. T4DNA连接酶 2. 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚 物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接 物法和接头连接法
用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断
在A和B分别中加入dATP和dTTP
同聚物尾巴10~40个碱基
同聚物加尾法
影响连接酶作用的因素 1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：
平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol~1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）
平末端
两条链上的断裂位置是处在一个 对称结构的中心这样形式的断裂是 形成具有平末端的DNA片断。不易 重新环化。
同裂酶（isoschizomers)
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ， 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割，而MspⅠ可以。
粘性末端DAN片断的连接
由于具粘性末端的载体易发生自连。 对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小 牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不 能自连。 而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进 行共价键的连接。这样形成的杂种分子中， 每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外 源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接， 形成3’- OH 和5’- OH 的缺口。
同聚物加尾法或T4连接酶的平 末端连接法，无法用原来的限制 酶作特异性的切割，获得插入片 断进行进一步的研究。
衔接物连接法
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker） 进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工 合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构 特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回 文结构。如：BamH I 或Sau3A Hpa IICCGGATCCGGHpa II GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限 制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着 一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与 修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
• R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
• 体外连接的三种方式： 1. 用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA 片断 2. 用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接； 或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA 片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ 连接酶连接。 3. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接 头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接
限制性核酸内切酶的命名原则： 第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的 第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的 第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌 株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制 酶。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于 其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基 序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽 然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲 基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸 （SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶 不能识别已甲基化的序列。