第三章 基因工程的酶学基础

核酸内切限制酶标准的缓冲液 1. 氯化镁、氯化钠或氯化钾：
不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性， 还可能导致识别序列的改变。
2. Tris-HCl ：
维持最适的pH值（ pH ＝7.4）。
3. β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT） ： 维持酶的稳定性。 4. 牛血清蛋白（BSA） ：维持酶的稳定性。
当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于 其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基 序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽 然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲 基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸 （SAM）将甲基转移给限制酶识别序列 的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶 不能识别已甲基化的序列。
核酸内切限制酶对DNA的消化作用 1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶 序列发生作用。 2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化
完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切 限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次 的水平。 局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的 DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有 所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶 消化反应。 a. 缩短酶切的消化反应的保温时间 b. 降低反应的温度（37--4）结束酶的活性。
3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化 作用
小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的片断） 大分子量的片断-----多（基因文库）
ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） 与分子的体外连接
末端核苷酸转移酶（terminal transferase）
该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它是从小牛胸腺 中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二 甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行 5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分 子加到线性DNA分子的3’-OH末端。 它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ 片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。 它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA, 也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA
平末端DNA片断的连接 1. T4DNA连接酶 2. 用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚 物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接 物法和接头连接法
用5’ 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断
在A和B分别中加入dATP和dTTP
同聚物尾巴10~40个碱基
同聚物加尾法
影响核酸内切酶活性的因素： 1.DNA的纯度： DNase的污染(Mg++) a.增加核酸内切限制酶的用量， b.扩大酶催化反应的体系（稀释）， c.延长酶催化反应的保温时间。 加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当 的温度。
2. DNA的甲基化程度 3. 酶切消化反应的温度： 大多数酶的标准反应温度 37度。 4. DNA的分子结构： 某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒 或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性 的DNA高29倍。
影响连接酶作用的因素 1. 反应温度： 连接缺口的温度：37度 连接粘性末端的最佳温度： 4～15度 2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：
平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10μmol~1mmol/L之间 3. 提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）
基因工程的酶学基础

限制性核酸内切酶 ＤＮＡ连接酶 DNA聚合酶
限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease）
这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内 切酶。
寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象：
Ⅲ型酶
这类酶可识别特定碱基顺序，并 在这一顺序的3’端24~26bp处切开 ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没 有特异性的。
Ⅱ型酶的基本特性
1. 在DNA双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子，产生链的断裂。 2. 两个单链断裂部位在DNA分子上的分 布，通常不是彼此直接相对的 3. 因此，断裂的结果形成的DNA片断， 也往往具有互补的单链延伸末端。
S1核酸酶： 来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链 DNA，用于将粘性末端水解成平末端及 cDNA发夹式结构的处理。 反转录酶（reverse transcriptase） 这类酶来自于反转录病毒，它可以 RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常 用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV） 反转录酶两种。
核酸内切酶作用后的断裂方式
粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是 围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形 成具有粘性末端的DNA片断。
具有3’-OH（ Pst1 ），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。 Pst1 EcoR1 5’CTGCAG 3’ 5’GAATTC 3’ 3’GACGTC 5’ 3’CTTAAG 5’
• 体外连接的三种方式： 1. 用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA 片断 2. 用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接； 或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA 片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ 连接酶连接。 3. 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接 头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接
R/M体系的作用： 保护自身的DNA不受限制； 破坏外源DNA使之迅速降解
• 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专 门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是 避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染， 是细胞中的一种防御机制。由于R/M现 象的发现使得核酸内切酶成为基因工程 重要的工具酶。 • 根据酶的功能、大小和反应条件，及切 割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶 分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
粘性末端DAN片断的连接
由于具粘性末端的载体易发生自连。 对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小 牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不 能自连。 而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进 行共价键的连接。这样形成的杂种分子中， 每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外 源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接， 形成3’- OH 和5’- OH 的缺口。
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点（hybrid site）
由一对同尾酶分别
产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
BclⅠ T GATC A
A CTAG T
杂种位点 ： GATC C （ BamHⅠ ）
CTAG T（ BclⅠ ）
用途： 1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’ 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’OH末端。 2. 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’末端： 生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生 物素蛋白结合物的接受位点。 3. 用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸， 从而形成粘性末端。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） 该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由 Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用 的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二 脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合 起来。 DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退 火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以 进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。
ＤＮＡ连接酶： 能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基 （ OH ）和5’-磷酸基团（-P），在 NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二 酯键。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口 （gap）。而且被连接的DNA链必须是双 螺旋DNA分子的一部分。
酶－－AMP（腺苷－磷酸） （赖氨酸残基）
碱性磷酸酶： 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA （RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH， 该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同 位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环 化）时可进行脱磷酸反应。
限制片断的末端连接作用 分子间的连接：不同的DNA片断通过互 补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连 接起来。 分子内的连接：由同一片断的两个互补 末端之间的碱基配对而形成的环形分子。
限制酶的特性
a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关； b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限 制酶只具一个限制位点的质粒）。
Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和 E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫 氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别 位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机 的，所以在基因工程中应用不大。
Ⅱ型酶
1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜 血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量较小（105Da），只有一种多肽， 通常以同源二聚体的形式存在。反应只需 Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这 类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 • 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位 点也在这一回文对称结构上。 • 许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形 成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。
平末端
两条链上的断裂位置是处在一个 对称结构的中心这样形式的断裂是 形成具有平末端的DNA片断。不易 重新环化。
同裂酶（isoschizomers)
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) ， 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割，而MspⅠ可以。
同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的 粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割 位点的选择余地更大。 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。 一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 BamHⅠ G GATC C
C CTAG G
磷酸酰胺键
DNA的腺苷酸复合物 3’-OH对P原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键
连接酶的作用机理
此反应是由焦磷酸 (ppi)的水解作用激发的 需要花费两个高能磷酸键
连接酶的来源
1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码的 2. T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的
DNA连接酶 －－NAD+ T4 DNA连接酶 －－ATP
人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着 一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与 修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别 自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。
• R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
百度文库
E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
限制性核酸内切酶的命名原则： 第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的 第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的 第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌 株号。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制 酶。
同聚物加尾法或T4连接酶的平 末端连接法，无法用原来的限制 酶作特异性的切割，获得插入片 断进行进一步的研究。
衔接物连接法
平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker） 进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工 合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构 特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回 文结构。如：BamH I 或Sau3A Hpa IICCGGATCCGGHpa II GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限 制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。