核酸的分离与纯化.
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①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤
a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后， 转入分光光度计的石英比色杯中。
b．分光光度计先用一定量的水校正零点。 c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d．计算浓度。
双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释 倍数×40/1000。 e．分析纯度。
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减 少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色 素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。
基因组DNA的分离纯化
• 玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于 带钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE
• 其他方法：异丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法
基因组DNA的分离纯化
• DNA样品的进一步纯化：透析，沉淀，电 泳，选择性沉淀
• 片段回收：
– 原则：提高回收率，去除杂质污染 – 从琼脂糖凝胶中回收：DEAE纤维素膜插片电
Home
基因组DNA的分离纯化
• 基因组DNA特点：线性DNA，长度长，在 溶液中黏稠，沉淀后难溶解，易断裂
基因组DNA的分离纯化
• 酚抽提法：以含EDTA，SDS及无DNA酶的 RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，再经蛋白酶K 处理，以pH8.0Tris饱和酚抽提DNA，再根 据需要纯化及浓缩。
• 甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法 一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA 与蛋白质，再以透析除去杂质
注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为
1.8的情况。
B：测RNA
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之 间，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及 盐存在。
Home
2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
Ribonucleoside Complex, VRC)
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2.1 细胞的破碎
(1) 高速组织捣碎机捣碎 (2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
Home
2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
Home
1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，
核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则：
碱裂解法
平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（DNA分配于有机相，酚 的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于 消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。
无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。
4）剧毒。
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下 12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温 下放置5-10分钟。 4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ, 盖紧管口，快速温和颠 倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管， 温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g 离心5-10分钟。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
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2.5 核酸的保存
(1) 对DNA
① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2) 对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
（2）异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的
核酸的分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
测定结果分析
A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／
OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和
小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
• 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或 碱进行处理及用加热处理
• 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌 使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要 求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取 决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后 用于纯化的技术和实验要求。
EDTA 作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活
溶液II 0.2M NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。
溶液III 5M KAC：乙酸钾：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85
混合 作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
碱裂解法
• 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓 扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复 中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共 沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。
• 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶 而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相 对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的 质粒可有三种结构：超螺旋、开环和复制中间体（即没有
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝
缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
1.2.1 DNA酶抑制剂ຫໍສະໝຸດ Baidu
复制完全的两个质粒连在了一起）
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬
抽提
溶液II裂解
乙醇沉淀
溶液III中和
离心洗涤
沉淀
干燥溶解
质粒DNA溶液
碱裂解法
（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭 菌锅
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂：
溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM
泳法，电泳洗脱法，冷冻挤压法 – 从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡
质粒DNA的提取和纯化
• 质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA • 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和
抗变性能力更强
质粒DNA的提取和纯化
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒 DNA释放法；酸酚法等。碱裂 解法有操作简便、快速、 得率高的优点。
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。
2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥 发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
（3）聚乙二醇（PEG）
优点： 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量
的DNA片段。应用6000相对分子质量的PEG进行 DNA沉淀时，使用浓度与DNA片段的大小成反比。 注意：
紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤
a．吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后， 转入分光光度计的石英比色杯中。
b．分光光度计先用一定量的水校正零点。 c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d．计算浓度。
双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释 倍数×40/1000。 e．分析纯度。
2. 2.3 酚/氯仿抽提
酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果， 并对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减 少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色 素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。
基因组DNA的分离纯化
• 玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于 带钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的TE
• 其他方法：异丙醇沉淀法，玻璃珠吸附法
基因组DNA的分离纯化
• DNA样品的进一步纯化：透析，沉淀，电 泳，选择性沉淀
• 片段回收：
– 原则：提高回收率，去除杂质污染 – 从琼脂糖凝胶中回收：DEAE纤维素膜插片电
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基因组DNA的分离纯化
• 基因组DNA特点：线性DNA，长度长，在 溶液中黏稠，沉淀后难溶解，易断裂
基因组DNA的分离纯化
• 酚抽提法：以含EDTA，SDS及无DNA酶的 RNA酶裂解缓冲液裂解细胞，再经蛋白酶K 处理，以pH8.0Tris饱和酚抽提DNA，再根 据需要纯化及浓缩。
• 甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法 一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA 与蛋白质，再以透析除去杂质
注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为
1.8的情况。
B：测RNA
纯的RNA样品其OD260／OD280应介于1.7-2.0之 间，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋 白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及 盐存在。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
Ribonucleoside Complex, VRC)
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2.1 细胞的破碎
(1) 高速组织捣碎机捣碎 (2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
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2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.1.1 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，
核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及 和其他生物大分子结合的方式。
1.1.2 分离核酸原则：
碱裂解法
平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离。平衡酚pH7.8（DNA分配于有机相，酚 的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于 消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。
无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA
作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。
使用注意：
1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍。
2）容易降解，保存在4 ℃或液氮中； 3）提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h。
4）剧毒。
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电 吸力(核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非 极性的范德华力。
分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合 的蛋白质分开，同时避免核酸降解。
2.2.1 加入浓盐溶液（如NaCl）
核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力， 使氢键破坏，核蛋白解聚；
2.2.2 加入SDS
SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还 具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下 12000g离心30秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温 下放置5-10分钟。 4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ, 盖紧管口，快速温和颠 倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟。 5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管， 温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g 离心5-10分钟。
2.4.2 溴乙锭荧光法测定核酸的含量
原理：DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基 平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可 发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使 用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照， 可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。
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2.5 核酸的保存
(1) 对DNA
① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2) 对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
终浓度(mol/L)
0.01 0.3 0.3 2.5 0.2 0.8
2.3.2 有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易
挥发除去，不影响以后实验。 缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
（2）异丙醇
优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的
核酸的分离纯化
主要内容
前言 1 核酸分离、纯化原则
1.1 保持核酸分子一级结构的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解
2 分离提取核酸的主要步骤
2.1 细胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、变性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的浓度测定 2.5 核酸的保存
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
测定结果分析
A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260m／
OD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和
小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。
• 概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或 碱进行处理及用加热处理
• 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌 使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要 求纯化质粒DNA，根据实验所需)选择哪一种方法主要取 决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后 用于纯化的技术和实验要求。
EDTA 作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活
溶液II 0.2M NaOH 1%SDS（新鲜配制）
作用:细胞壁肽聚糖碱性下水解,核酸和蛋白质变性。
溶液III 5M KAC：乙酸钾：冰乙酸：水，按6：1.15：2.85
混合 作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉 淀， K＋可中和DNA
碱裂解法
• 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓 扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复 中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共 沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。
• 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶 而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相 对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的 质粒可有三种结构：超螺旋、开环和复制中间体（即没有
PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L 的MgCl2。
（4）精胺
精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNA。
原理是： 精胺与DNA结合后，使DNA在溶液中结构凝
缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质 杂质与DNA分开，达到纯化DNA的目的。
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
使用酚时应注意
(1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉 红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如 醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验， 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时 应戴手套。
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2.3 核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
(1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因 此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉； (2） 阴离于型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还 能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷 的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
1）温度不要过高； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓 冲液中需加核酸酶抑制剂。
1.2.1 DNA酶抑制剂ຫໍສະໝຸດ Baidu
复制完全的两个质粒连在了一起）
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬
抽提
溶液II裂解
乙醇沉淀
溶液III中和
离心洗涤
沉淀
干燥溶解
质粒DNA溶液
碱裂解法
（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭 菌锅
（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂：
溶液I 50mM 葡萄糖 25mMTris·HCl（pH8.0）10mM
泳法，电泳洗脱法，冷冻挤压法 – 从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡
质粒DNA的提取和纯化
• 质粒的结构：超螺旋，半开环，线性DNA • 理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和
抗变性能力更强
质粒DNA的提取和纯化
• 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒 DNA释放法；酸酚法等。碱裂 解法有操作简便、快速、 得率高的优点。
1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。