植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究

植物病原菌诱导表达载体构建及在烟草中的瞬时表达研究
欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华
【摘要】According to the sequences of pathogen-inducible plant promoters PPP3 at GenBank,PPP3 promot-ers was cloned from tobacco genome .It was used to replace cauliflower mosaic virus 35 S promoter of pCAM-BIA1301 .The recombinant plasmid was used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101 .The inducibility of the PPP3 promoters in tobacco leaf was evaluated by Agrobacterium tumefaciens-transient genetic transformation as-sye .Real-time quantitative PCR was used to screen the PPP 3 promoters with high inducible expression .The results showed that the gus transcript level under the control of PPP 3 promoters increased respectively 27 .94 fold and 17.69 fold after inoculation with Ralstonia solanacearum and SA.The PPP3 promoter had the advantages such as low basal activity and high expression activity .%根据GenBank中植物病原物诱导型启动子碱基序列设计引物，以烟草基因组DNA
为模板，扩增PPP3启动子。

用PPP3替换pCAMBIA1301中与gus基因相连的35S启动子，构建重组质粒pCOMBIA ＋PPP3＋gus后导入农杆菌GV3101。

通过农杆菌介导的瞬时表达技术将受PPPs控制的gus基因导入烟草。

分别接种青
枯菌和水杨酸24 h后，烟草叶片中检测到gus基因转录效率分别提高了27．94，17．69倍。

表明PPP3启动子具有本底表达水平低、诱导表达活性强的特点。

【期刊名称】《华北农学报》
【年(卷),期】2013(000)004
【总页数】5页(P41-45)
【关键词】诱导型启动子;瞬时表达;定量PCR
【作者】欧阳乐军;黄真池;沙月娥;曾富华
【作者单位】湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048;湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048;湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048;湛江师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048
【正文语种】中文
【中图分类】Q786
近年来越来越多的研究表明,农杆菌介导的瞬时表达技术是一种快速有效的分析基因表达的方法[1]。

该方法同样也是以农杆菌介导法为基础,将外源基因导入植株叶片后,短时间内就可进行快速检测。

因此,瞬时表达技术具有操作简易、周期短以及表达高效等优点,目前在多种植物中已有运用该方法进行启动子功能分析的成功报道[2-7]。

当前,要想运用诱导表达策略提高外源抗性基因的表达效率与转基因技术的实际应用效果,就必须找到真正具有高效诱导表达活性的病原物诱导型启动子。

研究表明,一个合适的病原物诱导型启动子往往具有本底活性低、诱导表达效率高、不受伤诱导等特点[8]。

但一种顺式作用元件往往同时受几种信号途径的调控,因此,要找到理想的病原物诱导型启动子不容易[9]。

本研究从烟草中扩增到的PPP3启动子置换pCAMBIA1301中的35S组成型启动子,调控gus报告基因表达。

经农杆菌介导法转入烟草叶片进行瞬时表达,通过实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR)检测接种病原物后GUS活性
变化,分析病原菌诱导型启动子PPP3诱导表达活性及特点。

探讨农杆菌介导的基因瞬时表达法在分析启动子表达活性中的应用,为快速筛选诱导因子广、诱导表达强度高、本底活性低的病原诱导启动子提供借鉴与参考。

1 材料和方法
1.1 植物材料
烟草(Nicotiana tabacum L.)种子,由湛江师范学院广东高校特色植物工程中心实验室保存,播种于土壤中,并将其放入(26±1)℃、16 h/d光照和50 μmol/(m2·s)光强的人工气体培养箱中培养。

60 d后用于农杆菌介导的基因瞬时表达。

1.2 菌株、质粒及试剂
农杆菌GV3101、pCAMBIA质粒由湛江师范学院广东高校特色植物工程中心实验室保存;E.coli DH5α、pMDTM19-T Vector 购自宝生物工程(大连)有限公司。

限制性内切酶、5 000 bp DNA Ladder Marker、Premix Taq Version 2.0、DNAiso Reagent购自宝生物工程(大连)有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、Trizol Reagent购自生工生物工程(上海)有限公司;PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成;小量质粒提取试剂盒购自天根生物公司;通用型PCR试剂盒琼脂糖购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯,购自广州化学试剂厂。

1.3 试验方法
1.3.1 PPP3启动子的克隆及诱导表达载体构建根据GenBank中病原菌诱导型启动子PPP3(AF469483)序列设计引物(下划线分别表示,Hind Ⅲ和NcoⅠ的酶切位点)。

Primer 1′：5′-GCAAGCTTGAAAAGGGTCCAGTCCT-3′;
Primer 2′：5′-GTCCATGGAGTACTATTTATAGTGAT ATATATGCT-3′。

以烟草基因组DNA为模板,PCR扩增PPP3启动子。

PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测后,用生工生物工程(上海)公司琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化目的
片段;回收的PCR产物分别连接克隆载体pMDTM19-T Vector ,然后转化E.coli DH5α;挑选平板中的白色菌落,进行PCR检测。

同时,用限制性内切酶Hind Ⅲ和NcoⅠ对提取的质粒进行酶切验证克隆子。

用Hind Ⅲ和NcoⅠ酶切重组质粒和pCAMBIA1301质粒,将酶切回收的PPP3小片段与酶切回收的pCAM质粒大片段进行连接后转化农杆菌,采用双酶切和PCR扩增法进行重组质粒
pCAM+PPP3+gus鉴定。

PCR扩增、酶切及回收、质粒提取、连接转化参照试剂盒操作说明。

1.3.2 农杆菌介导的瞬时表达分析烟草中瞬时表达方法参照文献[1]。

将含质粒pCOMBIA+PPP3+gus的农杆菌GV3101培养在含Rif(50 μg/mL)和Kan(50
μg/mL)的LB培养基中,于28 ℃,200 r/min培养直至OD600为0.6。

用无针头的注射器将农杆菌接种于烟草叶表面,接种后的植株放于26 ℃控湿培养箱,12 h后分别用青枯菌及水杨酸处理,处理12 h后提取叶片RNA。

1.3.3 瞬时表达叶片组织化学染色分析将青枯菌及水杨酸处理12 h后,烟草叶片浸染于X-Gluc溶液,GUS染色方法参照魏开发[10]的方法。

1.3.4 总RNA提取及cDNA合成接种后取15～20 mg烟草叶片,用液氮充分研磨后用上海生工 Trizol Reagent提取总RNA,具体方法参照说明书。

以RNA为模板用于Reverse transcriptase-PCR(PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real Time)反应得到cDNA。

反应体系：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL,RNA 5 μL,RNasel-free ddH2O 3 μL;PCR程序：37 ℃,15
min;85 ℃,5 s,4 ℃保存。

1.3.5 实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,QPCR) 使用Primer 3设计QPCR引物,引物长度18～25 bp,融解温度在50～65 ℃,引物的GC含量为50%～60%,避免超过3个G或C重复片段。

gus的上游引物：5′-CTGATAGCGCGTGACAAAAA-3′;gus的下游引物：5′-
GGCACAGCACATCAAAGAGA-3′;内参基因actin 的上游引物：5′-ACATTGTGCTCAGTGG TGGA-3′;actin的下游引物：5′-CAAGATAGAGCC TCCGATCC-3′。

按步骤2.3提取烟草总RNA并进行两步法RT-PCR,合成得到cDNA溶液进行QPCR。

QPCR反应体系为25 μL,模板量为2 μL cDNA,每个反应设置3个重复。

QPCR程序为：94 ℃,10 s 预变性;94 ℃ 10 s变性,55 ℃ 15 s,72 ℃延伸15 s。

反应结束后分析PCR产物的特异性。

数据分析方法采用相对定量的Pfaffl法[11],用Opticon Monitor 3进行数据统计分析。

计算公式如下：
公式中Etarget和Eref分别是目的基因和参照基因的扩增效率。

2 结果与分析
2.1 诱导表达载体构建
2.1.1 PPP3启动子的克隆以烟草基因组DNA为模板可扩增出大小为220 bp的DNA片段,其大小正好与GenBank中所报道的细菌诱导型启动子PPP3(图1)的大小相符。

M.100 bp DNA Marker;1.阴性对照;2～5.PPP3扩增片段。

M.100 bp DNA Marker;1.Negative control;2-5.PPP3 were amplified from tobacco genomic.图1 烟草细菌诱导型启动子PPP3的扩增
Fig.1 The amplification of bacteria-induciblepromoter PPP3 from tobacco genomic
2.1.2 pMDTM19-T-PPP3 转化大肠杆菌的鉴定以重组质粒为模板,进行PCR扩增,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,扩增产物片段大小为220 bp左右(图2-A)。

用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切重组大肠杆菌质粒,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,出
现2条条带,其中 PPP3片段大小约220 bp(图2-B)。

A.pMDTM19-T-PPP3质粒中PPP3 PCR检测;M.5 000 bp DNA Marker;1～
4.PPP3的阳性克隆;
5.pMD19-T为模板的阴性对照;B.pMDTM19-T-PPP3质粒的双酶切检测;M.5 000 bp DNA Marker;1～2.重组质粒。

A.The amplification of PPP3 from pMDTM19-T-PPP3;M.5 000 bp DNA Marker;1-4.Positive clone of PPP3;5.Negative control;
B.Double restriction enzyme digestion intermediate vector pMDTM19-T-PPP3;M.5 000 bp DNA Marker;1-2.Recombinants pMDTM19-T-PPP3 cut by restriction enzymes. 图2 重组质粒pMDTM19-T-PPP3的鉴定
Fig.2 Identification of the recombinants pMDTM19-T-PPP3
2.1.3 pCAMBIA1301+PPP3+gus转化农杆菌的鉴定将PPP3与pCAMBIA1301 Vector质粒连接后,转化农杆菌,经抗生素筛选,再进行菌落PCR验证,可扩增到大小为220左右的片段,符合PPP3的大小(图3-A)。

用Hind Ⅲ、NcoⅠ双酶切反应,酶切重组农杆菌质粒pCAMBIA1301-PPP3,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,出现2条条带,其中 PPP3片段大小约220 bp(图3-B)。

将阳性质粒送至上海生工测序,测序结果如下：AAATCATGTTCTGACGGAGGACAACTTAGTTTT TTCTACTAGAAAGAATATTTTGACGAATTTCGTTCA CATTGGCATGCTTTAATTATATTAAGTAGTCTTTCTT GGAAAAGAAGTATTTGCAATATCAAACCAAATCTT CCCATTACGCAAGCAATGACATCTAAGCATATATAT CACTATAAATAGACTGGATCCACCAAA
经过序列比对,克隆的PPP3序列结果与GenBank 中AF469483的碱基序列完全
一致。

A.pCAMBIA1301-PPP3重组质粒的PCR检测;M.5 000 bp DNA Marker;1～
4.PPP3的阳性克隆;0.阴性对照;B.pCAMBIA1301-PPP3质粒的双酶切检测;M.λ DNA Ladder Marker;1～2.重组质粒。

A.The amplification of PPP3 from pCAMBIA1301-PPP3.M.5 000 bp DNA Marker;1-4.Positive clone of PPP3;0.Negative control;
B.Double restriction enzyme digestion intermediate vector pCAMBIA1301-PPP3;M.λDNA Ladder Marker;1-2.Recombinants pCAMBIA1301-PPP3 cut by restriction enzymes.
图3 重组质粒pCAMBIA1301-PPP3的鉴定
Fig.3 Identification of the recombinants pCAMBIA1301-PPP3
2.2 接种叶片GUS染色情况
将已进行农杆菌浸染的烟草叶浸泡于X-Gluc溶液后得到蓝色区域,蓝色区域显示的大小和颜色的深度与启动子表达活性呈正相关,未接种青枯菌与水杨酸的叶片部位没有蓝色产生(图4)。

A,B.上部接种无菌水,下部接种青枯菌;C.上部接种无菌水,下部接种水杨酸。

A,B.The upper leaf were inoculated with sterilized water,The lower leaves were inoculated with R.solanacearum;C.The upper leaf were inoculated with sterilized water,The lower leaves were inoculated with salicylic acid. 图 4 GUS染色结果
Pig.4 Histochemical assay withstaining buffer containing X-Gluc
2.3 RNA提取及QPCR分析
2.3.1 RNA提取用无针头的注射器将含瞬时表达质粒的农杆菌接种于烟草叶表面,12 h后用青枯菌及水杨酸处理,处理12 h后提取叶片RNA。

图5中条带清晰,无明显降解,28S rRNA对应的条带亮度约为18S rRNA对应的条带亮度的2倍,可用作后续试验模板。

2.3.2 实时定量PCR分析目的的基因的诱导表达由图6可知，gus基因的实时定量PCR扩增效果较好，将表1数据代入1.3.5的计算公式中，可计算出转基因植株接种青枯菌后，gus基因转录效率提高到原来的27.94倍，接种水杨酸后基因转录效率提高到原来的17.69倍(图7)。

说明PPP3启动子受多种诱导因子影响，调控gus基因表达。

图5 烟草叶片总RNA的提取
Fig.5 Extraction of total RNA of tobacco leaves
a.gus基因QPCR融解曲线;
b.烟草接种青枯菌后gus基因的表达变化;A.接种叶片gus基因表达曲线;B.未接种叶片gus基因表达曲线;
c.烟草接种水杨酸后gus基因的表达变化;A.接种叶片gus基因表达曲线;B.未接种叶片gus基因表达曲线。

a.The melting curve of gus gene;b.The expression of gus gene after inoculated with R.solanacearum;A.The expression of gus gene after inoculated with R.solanacearum;B.The expression of gus gene without inoculation;c.The expression of gus gene after inoculated with salicylic acid;A.The expression of gus gene after inoculated with salicylic acid;B.The expression of gus gene without inoculation.
图6 Gus基因QPCR融解曲线及扩增效率
Fig.6 The gus gene amplification efficieny and melting curve of cDNA
表1 烟草中gus和actin基因Ct值变化Tab.1 The change of cycle threshold
of gus and actin in tobacco处理TreatmentActin 扩增效率Amplification efficieny of Actin管家基因扩增数循环数Actin CtGus扩增效率Amplification efficieny of GusGus基因扩增循环数Gus Ct未接种 Non-
inoculation2.213.62.516.5接种青枯菌 Inoculated with
R.solanacearum2.214.82.513.9接种水杨酸 Inoculated with salicylic
acid2.214.32.514.1
图7 病原诱导启动子PPP3诱导表达特性分析
Fig.7 Induced expression characteristics analysis of PPP3
3 讨论
近年来,农杆菌渗入法应用范围不断扩大,瞬时表达的部位也不断扩大。

由于基因瞬时表达法存在省时省力、周期快、结果可靠等优点,因此已被广泛应用于启动子分析、基因功能鉴定等。

自从Yang 等[2]以gus为报告基因,采用农杆菌渗入法分析植株受到生物或非生物胁迫时,顺式元件和转录因子之间的关系以来,农杆菌介导的瞬时表达技术就逐渐成为一种分析植物启动子功能的有效、快速方法。

当然,瞬时表达中,表达产物的稳定性以及表达后检测时间等问题也会影响其检测结果的准确性。

在今后的研究中需要进一步提高分析手段与检测技术的科学性,以提高瞬时表达技术的实际应用效果。

在外源基因遗传转化过程中,通常是将抗病基因置于组成型启动子控制下,但是组成型表达抗病基因在植物体内持久的高水平表达,导致不良农艺、经济性状的出现,进而使产量和生物量降低。

如果采用诱导表达策略,植物不被病菌侵染时,外源基因只有极低的表达水平,则对非目标性状的不利影响小;相反,外源基因只有在病原物侵染时才被启动表达,则可极大地增强外源基因的表达时效性与针对性。

同时,利用病原物诱导型启动子,生态安全性高,对环境的不利影响也小。

PENG等[12]从烟草中克隆了植物病原菌诱导型启动子PPPs。

将克隆的启动子和uidA基因连接后转化烟
草,对转基因烟草GUS组织化学测定,3个启动子都可以受青枯菌和SA的诱导。

本研究利用农杆菌介导的瞬时表达法分析本研究所构建的PPP3病原诱导启动子活性,并用QPCR对接种人工病原诱导启动子的烟草叶片GUS活性进行分析,结果表明,受PPP3启动子调控的gus基因在接种青枯菌后,转录效率提高了27.94倍,接种水杨酸后基因转录效率提高了17.69倍。

说明PPP3启动子具有诱导因子广、诱导表达活性高的优点。

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