热点实验：明胶酶谱MMP活性检测实验案例介绍

大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验

实验仪器泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323)；电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

实验标本大鼠心脏组织20个

实验试剂

1、凝胶试剂：30%丙烯酰胺溶液；Tris-Base（SIGMA）；10%SDS（SIGMA）；10%过硫酸铵；TEMED （sigma）

2、常用溶液及缓冲液：制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶：采用8%分离胶。将20Xsubstrater 融化，并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

A．5%积层胶所用溶液

按总体积2.5ml：

ddH2O： 1.575ml

30%丙烯酰胺溶液： 0.42ml

1.0mol/L Tris (PH=6.8)： 0.315ml

10%SDS： 25ul

20Xsubstrate： 125ul

10%过硫酸铵： 25ul

TEMED： 3ul

B．8%分离胶溶液

按总体积10ml：

ddH2O： 4.1ml

30%丙烯酰胺溶液： 2.7ml

1.0mol/L Tris (PH=8.8)：

2.5ml

10%SDS： 100ul

20Xsubstrate： 500ul

10%过硫酸铵： 100ul

TEMED： 6ul

C．电泳缓冲液，1L

3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS，加蒸馏水至IL，pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液，在室温下长期保存。

检测步骤

A、阳性对照及待检测样品的前处理及上样阳性对照：取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1：1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer，混合后直接上样。不加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。

B、电泳 30mA恒流电泳45min，溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

C、洗涤凝胶驱除凝胶，去除压缩胶。放入容器中，先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml

1Xbuffer A，室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。

D、孵育倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B，室温孵育4小时。

E、显色倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后，

再采用脱色液（甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %）进行脱色60min。

F、条带扫描将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描，显示调整为灰度。并分析IOD值。72

kDa为MMP-2，92 kDa为MMP-9。

试剂盒组成与储存

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃

2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃

3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃

4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃

5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃

6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃

实验结果

注：阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD（integrated optical

density）累积光密度参考值。(例如：1.33E+05=1.33×105)。P: positive mixture每孔

点样蛋白约10ug

Lanes:Lane1Lane2Lane3Lane4Lane5Lane6Lane7Lane8Lane9LaneP Rows(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD) MMP-916200202002670033200304744330038600351312350060323 MMP-2125351018841297412322.612170.211685124819677.51252216578样本123456789P

Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Lane 6Lane 7Lane 8Lane 9Lane P Rows(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD)(IOD) MMP-925390255004490042000603004340043100366003340067703 MMP-210120120531379715995151381313915800124471251414632样本101112131415161718P

Lanes:Lane 1Lane 2Lane P

Rows(IOD)(IOD)(IOD)

MMP-9290006642466935

MMP-23164.79350.613975

样本1920P

实验咨询：service@

嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。

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