11分子荧光分析法分解
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道中分子内同一轨道中两个电子必须有相反的自旋方向，即自 旋量子数分别为1/2和-1/2.
总自旋量子数：S Si 分子的多重性：M=2S+1
S=0，M=1
S=1，M=3
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态 时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式 失去能量，称为去激发过程。
传递途径 辐射跃迁
无辐射跃迁
第十一章 分子荧光分析法
Molecular fluorescence analysis
光谱法：
概述
按电磁辐射的能级跃迁方向分 ： 吸收光谱法（从基态跃迁到激发态） 发射光谱法（激发态跃迁回基态）
按电磁辐射的作用对象分 ： 原子光谱 分子光谱
➢紫外及可见分光光度法：分子吸收光谱法 ➢分子荧光分析法：分子发射光谱法
2.2 荧光波长比激发波长较长: 荧光发射能量以激发能量低，故荧光发射波长总
是大于激发光谱波长。——Stokes shift 1852
光谱图中，激发光谱总是在左，发射光谱总是在右。
2.3 激发光谱与荧光光谱呈现镜像对称关系
100 80 60 F 40
20
0 200
a
b2 b1 cb00
c1 c2
b4 b3
萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
注：相当于荧光物质的吸收光谱； 激发荧光最灵敏波长（ex）是荧光强度最大所对应波长。
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光 波长为最大激发波长，测 定不同荧光波长下的荧光 强度，以发射波长为横坐 标，荧光强度为纵坐标作 图，得到荧光发射光谱。
最大荧光波长（em） ：光 萘的激发光谱、荧光和磷光光谱 谱上荧光强度最大的波长。
c3
c4
280
360 440
520
V=4 V=3 V=2
∆E4
∆E3
V=1 V=0
∆E2 ∆E1
b4 b3 b2 b1 b0
c0c1 c2 c3 c4
V=4
∆E4
V=3 V=2 V=1
∆E3
∆E2 ∆E1
V=0
蒽的激发光谱（虚线） 荧光光谱（实线）
nm
S1
蒽的能级跃迁
S0
二、荧光与分子结构的关系
荧光物质应具备的条件： 1、分子具有强的吸收紫外可见辐射的结构（内因） 2、具有较高的荧光效率
荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em） 是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。
荧光光谱的特征
2.1 荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，但均回到第一激发
单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光 发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与 激发波长无关。
外部能量转换(external conversion)：激发分子与 溶剂或其他溶质分子之间相互碰撞失去能量，并 以热能的形式释放能量的过程。外转换使荧光或 磷光减弱或“猝灭”。
体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态分 子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程；分子由激发单重态通过体系间跨越到 激发三重态。条件：激发态的振动能级有重叠时 宜发生。
荧光
磷光 系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
非辐射能量传递过程
振动弛豫(vibrational relexation)：各振动能级的分子 通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶 剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能 级间的过程；发生振动弛豫的时间10 -12s。 内部转换(internal conversion)：当两个电子激发态 之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受 激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子 能级的过程。
（一）荧光效率
ຫໍສະໝຸດ Baidu
发射的荧光量子数 吸收的光量子数
kF
kF
ki
KF荧光发射的速率常数， ki无辐射跃迁的速率常数之和；
荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境 条件有关。
（二）分子结构与荧光的关系 荧光物质的分子结构应具备如下特征： 1. 长共轭结构（芳香族烃）
ex 205nm
286nm
356nm
em 278nm 0.11
321nm 0.29
404nm 0.36
通常，具有—*跃迁结构的分子最容易产生荧光
而且共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移。
2. 分子的刚性
分子刚性越强，分子振动越少，与其它分子碰撞
失活的机率下降，荧光效率提高。
O-
O
O
O-
O
C COO-
C COO-
荧光素 Φ= 0.92，0.1M NaOH
化学发光：以化学反应能激发而发光
光致发光包括荧光和磷光 荧光包括分子荧光和原子荧光 分子荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强 度，对物质进行鉴定和定量的分析方法。
优点：灵敏度高，比紫外可见光谱法高2-4个数量 级； 选择性好。
缺点：应用范围小。
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
1.分子荧光的发生过程 基态分子中，电子按能量最低原理成对地排列于一定的轨
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
2. 荧光激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum）：固定荧光波 长，改变激发光波长，测 定不同波长光照射下荧光 强度的变化，以激发波长 为横坐标，荧光强度为纵 坐标，可得荧光物质的激 发光谱。
发光分析法
物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态, 当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时,便产生分 子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法。
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下 几类：
光致发光：以光源来激发而发光
发射
电致发光：以电能来激发而发光
生物发光：以生物体释放的能量激发而发光
3. 取代基对分子荧光的影响
酚酞 非荧光物质
①给电子基团如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等，使荧光增强。
辐射能量传递过程 荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振 动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐 射称为荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光 波长大于激发波长；荧光是相同多重态间的允许 跃迁，产生速度快，荧光发射时间为10-9-10-7s。
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
总自旋量子数：S Si 分子的多重性：M=2S+1
S=0，M=1
S=1，M=3
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态 时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式 失去能量，称为去激发过程。
传递途径 辐射跃迁
无辐射跃迁
第十一章 分子荧光分析法
Molecular fluorescence analysis
光谱法：
概述
按电磁辐射的能级跃迁方向分 ： 吸收光谱法（从基态跃迁到激发态） 发射光谱法（激发态跃迁回基态）
按电磁辐射的作用对象分 ： 原子光谱 分子光谱
➢紫外及可见分光光度法：分子吸收光谱法 ➢分子荧光分析法：分子发射光谱法
2.2 荧光波长比激发波长较长: 荧光发射能量以激发能量低，故荧光发射波长总
是大于激发光谱波长。——Stokes shift 1852
光谱图中，激发光谱总是在左，发射光谱总是在右。
2.3 激发光谱与荧光光谱呈现镜像对称关系
100 80 60 F 40
20
0 200
a
b2 b1 cb00
c1 c2
b4 b3
萘的激发光谱、荧光和磷光光谱
注：相当于荧光物质的吸收光谱； 激发荧光最灵敏波长（ex）是荧光强度最大所对应波长。
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发光 波长为最大激发波长，测 定不同荧光波长下的荧光 强度，以发射波长为横坐 标，荧光强度为纵坐标作 图，得到荧光发射光谱。
最大荧光波长（em） ：光 萘的激发光谱、荧光和磷光光谱 谱上荧光强度最大的波长。
c3
c4
280
360 440
520
V=4 V=3 V=2
∆E4
∆E3
V=1 V=0
∆E2 ∆E1
b4 b3 b2 b1 b0
c0c1 c2 c3 c4
V=4
∆E4
V=3 V=2 V=1
∆E3
∆E2 ∆E1
V=0
蒽的激发光谱（虚线） 荧光光谱（实线）
nm
S1
蒽的能级跃迁
S0
二、荧光与分子结构的关系
荧光物质应具备的条件： 1、分子具有强的吸收紫外可见辐射的结构（内因） 2、具有较高的荧光效率
荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em） 是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。
荧光光谱的特征
2.1 荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，但均回到第一激发
单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光 发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与 激发波长无关。
外部能量转换(external conversion)：激发分子与 溶剂或其他溶质分子之间相互碰撞失去能量，并 以热能的形式释放能量的过程。外转换使荧光或 磷光减弱或“猝灭”。
体系间跨越(intersystem crossing)：处于激发态分 子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变 化的过程；分子由激发单重态通过体系间跨越到 激发三重态。条件：激发态的振动能级有重叠时 宜发生。
荧光
磷光 系间跨越 内转换 外转换 振动弛豫
非辐射能量传递过程
振动弛豫(vibrational relexation)：各振动能级的分子 通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶 剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能 级间的过程；发生振动弛豫的时间10 -12s。 内部转换(internal conversion)：当两个电子激发态 之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受 激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子 能级的过程。
（一）荧光效率
ຫໍສະໝຸດ Baidu
发射的荧光量子数 吸收的光量子数
kF
kF
ki
KF荧光发射的速率常数， ki无辐射跃迁的速率常数之和；
荧光效率与物质的分子结构和所处的化学环境 条件有关。
（二）分子结构与荧光的关系 荧光物质的分子结构应具备如下特征： 1. 长共轭结构（芳香族烃）
ex 205nm
286nm
356nm
em 278nm 0.11
321nm 0.29
404nm 0.36
通常，具有—*跃迁结构的分子最容易产生荧光
而且共轭度越大，荧光效率越大，荧光波长长移。
2. 分子的刚性
分子刚性越强，分子振动越少，与其它分子碰撞
失活的机率下降，荧光效率提高。
O-
O
O
O-
O
C COO-
C COO-
荧光素 Φ= 0.92，0.1M NaOH
化学发光：以化学反应能激发而发光
光致发光包括荧光和磷光 荧光包括分子荧光和原子荧光 分子荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强 度，对物质进行鉴定和定量的分析方法。
优点：灵敏度高，比紫外可见光谱法高2-4个数量 级； 选择性好。
缺点：应用范围小。
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
1.分子荧光的发生过程 基态分子中，电子按能量最低原理成对地排列于一定的轨
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
2. 荧光激发光谱和发射光谱
激发光谱（excitation spectrum）：固定荧光波 长，改变激发光波长，测 定不同波长光照射下荧光 强度的变化，以激发波长 为横坐标，荧光强度为纵 坐标，可得荧光物质的激 发光谱。
发光分析法
物质分子吸收了一定能量后,其电子由基态跃迁至激发态, 当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时,便产生分 子发光。根据这种现象建立的分析方法称为发光分析法。
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下 几类：
光致发光：以光源来激发而发光
发射
电致发光：以电能来激发而发光
生物发光：以生物体释放的能量激发而发光
3. 取代基对分子荧光的影响
酚酞 非荧光物质
①给电子基团如-NH2、-OH、-OCH3、-CN等，使荧光增强。
辐射能量传递过程 荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振 动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐 射称为荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光 波长大于激发波长；荧光是相同多重态间的允许 跃迁，产生速度快，荧光发射时间为10-9-10-7s。
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。