小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤:
1、于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑；
2、预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块；
3、移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min；
4、将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液；
5、最后再用接种液1ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用；
6、加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块；
7、收集含单细胞悬液的上清液约4-5ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中；
8、培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况；
9、换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5ug/ml，换半液)培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞；
10、每隔3d换全培养液1次，每次换半液。

神经元免疫化学鉴定:
1、4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次；
2、加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30min，PBS洗涤3次；
3、加入5%羊血清封闭20min，弃去多余液体；
4、加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4h，PBS洗涤3次；
5、加入Cy3-羊抗兔IgG（1:50）和20µl抗荧光衰减封片剂，室温放置1h；
6、加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10min；PBS洗涤3次。

7、荧光显微镜观察；。