实验2-1动物肝脏DNA提取报告

(三)除去RNA的方法
脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中
溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很
低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，
利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋 白分离开来。
(四)除去蛋白质的方法
➢ 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性， 然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相 及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95 ％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。
（3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳
分离。
琼脂糖浓度
/%
0.3
0.6
0.7
0.9
1.2 1.5
线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5
0.2 2-0.1
2.0 6-0.4 3-
琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：
（1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度 快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电 泳。 （2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率 高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外 光检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制 成干膜可长期保存。
细胞破碎方法—化学方法
有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶 剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处 理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂， 此法也可以与研磨法联合使用。
溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液 和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差， 溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出 细胞内含物。
➢ 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可 以直接从生物材料中提取DNA。
纯的DNA样品的获得
➢ 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入 适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸， 以降低DNA酶的活性。
➢ 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的 DNA。
➢ 保 存 ： 将 DNA 于 滤 纸 上 干 燥 ， 溶 于 1mlTE中低温保存。
组织捣碎器：较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热 和升温过高，通常是转10秒—20秒，停10秒—20秒， 可反复多次。
压榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa 的高压下使 几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细 胞将彻底破碎。温和的、彻底破碎细胞的方法，但仪器 费用较高。
细胞破碎方法—机械物理法
蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除 去蛋白质。)
➢ 设法除去RNA的污染； ➢ 防止DNA酶的降解作用；
选材
要提取动物组织DNA，一般选择 细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏 器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。
细胞破碎方法—机械物理法：
研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少 量石英砂研磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合 实验室使用。
实验一
动物肝脏中DNA的制备
学时：4
一、实验目的：
1、掌握动物组织总DNA的特性 2、掌握动物组织总DNA提取方法及其原理。
二、实验原理:
（一）动物肝脏DNA制备原理
要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： ➢ 如何选材，如何破碎组织细胞？ ➢ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究 中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相 对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。
荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察 到的电泳结果：
* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？
1、原理：
EB： 即 3 , 8 - 二 氨 基 -5 - 乙 基 - 6 - 苯 基 菲锭 溴 盐 (Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧 光。
荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光， 并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm 和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发 出波长为590nm的红橙色荧光。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶 放在含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至 更少的DNA。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电 场中向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关 外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶 的分子筛效应）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的 确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的 两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的 激发下发出橙黄色的荧光。
（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种 电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方 法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方 法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由 半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼 脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的 凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比 琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－ 20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引 起细胞溶胀破碎。
超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞 壁和细Байду номын сангаас器。使用时注意降温，防止过热。
冷热交替法：在90℃左右维持数分钟，立即放 入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分 细胞可以被破碎。
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较，便可测出未知片段的大小。
（2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环 状DNA.