6种区分乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸_省略_球菌乳脂亚种的分子生物学方法比较_张家超

Method 16S rRNA Gene analysis 16 S-23 S rRNA ISRs Polymorphism RFLP
DGGE
Rep-PCR RAPD
Primer A27 F A1495 R LI G1 Y1 Y2
V3 F
V3 R GTG5 M13
表 1 试验所用引物 Table 1 Primers used in this study
乳酸乳球菌（ Lactococcus lactis） 归属于硬壁菌门 （ Firmicutes） 杆 菌 纲 （ Bacilli ） 乳 杆 菌 目 （ Lactobacillales） 链 球 菌 科 （ Streptococ-caceae ） 乳 球 菌 属 （ Lactococcus） 。其细 胞 呈 球 形 或 者 卵 圆 形，在 液 体 培养 基 中 成 对 或 短 链 生 长［1］。 Lactococcus lactis 包 含有 3 个亚种，分 别 是 乳 酸 乳 球 菌 乳 酸 亚 种 （ Lactococcus lactis subsp. lactis ） ，乳 酸 乳 球 菌 乳 脂 亚 种 （ Lactococcus lactis subsp. cremoris） 和 乳 酸 乳 球 菌 霍 氏亚种（ Lactococcus lactis subsp. hordniae） ，而前两个 亚种最初被鉴定归属于乳酸链球菌乳酸亚种（ Streptococcus lactis subsp. lactis ） 和 乳 酸 链 球 菌 乳 脂 亚 种 （Streptococcus lactis subsp. cremoris），直到 1985 年，才由 Schleifer 等人重新划分为 Lactococcus lactis 的亚种［2］。
在乳制品 的 生 产 发 酵 过 程 中，Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 发挥
了重要作用，尤其 是 在 干 酪 的 生 产 过 程 中。 通 常 情 况下，Lactococcus lactis subsp. cremoris 被用来生产硬 质干酪 （ 特 别 是 Cheddar 干 酪） ，而 Lactococcus lactis subsp. lactis 则 广 泛 应 用 于 软 质 干 酪 的 生 产［3］。 所 以 ，从 工 业 生 产 和 科 学 研 究 的 角 度 ，对 这 两 个 亚 种 的 区分就显得尤为重要。
早在 1919 年，Jensen 等人便依靠表型特征对这 两个亚种 进 行 了 区 分，可 是 区 分 效 果 并 不 理 想［4］。 近 些 年 来 ，随 着 科 学 技 术 的 不 断 发 展 ，越 来 越 多 的 科 研工作者以核酸碱基排 列 顺 序 不 同 为 契 机，从 DNA 结构层面，应用各种 分 子 生 物 学 技 术 对 这 两 个 亚 种 进 行 了 区 分，比 如 16S rRNA 基 因 序 列 分 析 技 术［5 － 7］，16 S-23 S rRNA 间区序列多态性分析［8 － 9］，变 性梯度凝胶电泳技术 （ DGGE ）［10 － 11］，随 机 扩 增 多 态 性分析技术（ RAPD）［12 － 13］，限 制 性 酶 切 片 段 多 态 性
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 50（12） ：1670 － 1676； 4 December 2010 ISSN 0001 － 6209； CN 11 － 1995 / Q http： / / journals. im. ac. cn / actamicrocn
Research Paper 研究报告
基金项目：国家自然基金项目 （30660135 ，30800861 ） ；国家“863 计划”（2006 AA10Z345 ，2007 AA10Z353 ） * 通信作者。Tel： + 86 -471 -4319940 ；Fax： + 86 -471 -4300122 ；E-mail：hepingdd@ vip. sina. com 作者简介：张家超（1986 － ） ，男，内蒙古包头人，博士研究生，研究方向为乳品生物技术。E-mail：zhjch321123 @ sohu. com 收稿日期：2010 -06-03；修回日期：2010 -07-04
6 种区分乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的分子生 物学方法比较
张 家 超 ，王 芳 ，源自文库 海 燕 ，于 洁 ，刘 文 俊 ，包 秋 华 ，孙 志 宏 ，张 和 平 *
（ 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）
摘要：【目的】比较并评价 6 种分子生物学技 术 对 乳 酸 乳 球 菌 乳 酸 亚 种 （ Lactococcus lactis subsp. lactis） 和 乳 酸乳球菌乳脂亚种（ Lactococcus lactis subsp. cremoris） 的区分效果。【方法 】采用 16S rRNA 基因序列分析技 术，16S-23S rRNA 间区序列多 态 性 分 析 技 术，变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 技 术 （ DGGE ） ，随 机 扩 增 多 态 性 分 析 技 术 （ RAPD） ，重复基 因 外 回 文 序 列 分 析 技 术 （ rep-PCR ） 和 限 制 性 酶 切 片 段 多 态 性 分 析 技 术 （ RFLP ） 对 4 株 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 参考菌株进行了区分，并对这 6 种方法的区 分效果进行了比较评价。【结果】16S rRNA 基 因 序 列 分 析 技 术，16S-23S rRNA 间 区 序 列 多 态 性 分 析 技 术 无 法区分 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris，而其余 4 种技术可以实现区分。【结 论】变性梯度凝胶电泳（ DGGE） ，随机扩 增 多 态 性 分 析 技 术 （ RAPD） 耗 时 短，操 作 简 单，试 验 结 果 准 确 稳 定， 更适合 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 的快速准确区分。 关键词： 乳酸乳球菌； 分类鉴定； 分子生物学方法 中图分类号： Q93-3 文献标识码：A 文章编号：0001-6209 （2010） 12-1670-07
合成引物 L1 和 G1［9］，在 94℃ 预 变 性 5 min；25 个循环：94℃ 变 性 1 min，55℃ 退 火 2 min，72℃ 延 伸 3 min；72℃ 末端延伸 10 min 的条件下扩增 4 株参考 菌株的 16S-23S rRNA 间区序列，将扩增产物用 2% 的琼脂糖凝胶在电 压 60 V 的 条 件 下 电 泳 3 h，而 后 将电泳凝胶用溴化乙锭（ EB） 染色并分析电泳结果。
张家超等： 6 种区分乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种的分子生物学……. / 微生物学报（2010）50（12）
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分析（ RFLP） 技术［14 － 15］以及重复基因外回文 序 列 分 析 技 术 （ rep-PCR ）［16］。 本 文 以 Lactococcus lactis subsp. lactis 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris 的 4 株参考菌株为研究 对 象，应 用 上 述 6 种 分 子 生 物 学 技术对这两个亚种 进 行 了 区 分，并 对 这 6 种 方 法 的 区分效果做出了比较和评价。
使用实验 室 自 主 设 计 的 引 物 A27F 和 A1495R 对参考菌 株 的 16S rRNA 片 段 进 行 扩 增，菌 体 扩 增 条件如下：94℃ 预 变 性 5 min；30 个 循 环：94℃ 变 性 1 min，58℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 2 min；72℃ 末端延 伸 10 min。然后将扩增成功的产物寄往上海桑尼生 物科技有限 公 司 测 序，将 测 序 结 果 上 传 到 NCBI 并 BLAST 比对，最 后 应 用 MEGA4. 0 软 件 做 出 系 统 发 育树完成同源性分析。 1. 4 16S-23S rRNA 间 区 序 列 多 态 性 分 析 （ 16S23S rRNA ISRs Polymorphism）
1. 5 变性 梯 度 凝 胶 电 泳 （ Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）
选用 引 物 V3F 和 V3R［18］，对 参 考 菌 株 的 16S rRNA 基因的 V3 区进行扩增，并将 300 ng 扩增产物 于 8% 的聚丙 烯 酰 胺 胶 上 进 行 分 离，变 性 剂 梯 度 范 围为 32% － 57% （100% 的变性剂包含 7 mol / L 尿 素和 40% 去离子甲酰胺） 。电泳在恒温 60℃ 下 1 × TAE 缓冲液中进 行，电 压 200 V，时 间 4 h。 电 泳 结 束后进行银染并对电泳图谱进行分析。 1. 6 随 机 扩 增 多 态 性 分 析 （ Random Amplified poly-morphism DNA，RAPD）
的 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris ATCC19257 作 为 试 验参考菌株。 1. 1. 2 试验主要试剂和仪器：伯乐公司变性梯度凝 胶电泳仪（ Dcode system） ，TGL-16B 型台式高速离心 机，ND-1000 型 微 量 紫 外 分 光 光 度 计，ML-30L 型 全 自 动 高 压 蒸 汽 灭 菌 器，HHSI-NI 恒 温 水 浴 槽， CDS8000 型 UPV 凝 胶 成 像 分 析 系 统，DHP-9272 型 电热恒温培 养 箱，HZS-H 水 浴 振 荡 器，PL303 /01 电 子天平，TGL-16G-A 型 高 速 冷 冻 离 心 机，DG82 型 干 燥箱，PTC-200 型 梯 度 基 因 扩 增 仪，电 泳 仪，本 试 验 所用引物均由上海 桑 尼 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成，具 体引物序列见表 1。
Reference This work This work ［9 ］ ［9 ］ ［21 ］ ［21 ］
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1. 2 菌株基因组 DNA 的提取 采 用 改 良 的 CTAB-冻 融 方 法 提 取 菌 株 基 因 组
DNA［17 ］，即 用 液 氮 反 复 冻 融 后 进 行 提 取 。 1. 3 16S rRNA 基因序列分析
Sequence （5′→3′ ） CTACGGCTACCTTGTTACGA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG GAAGTCGTAACAAGG CAAGGCATCCACCGT TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGG CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG GTGGTGGTGGTGGTG GAGGGTGGCGGTTCT
1 材料和方法
1. 1 材料 1. 1. 1 试验参考菌株：本试验以购买自中国普通微 生物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 （ CGMCC ） 的 Lactococcus lactis subsp. lactis AS 1. 18 和 Lactococcus lactis subsp. cremoris AS 1. 9，以及 美 国 标 准 菌 种 收 藏 所 （ ATCC ）