小鼠N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶NAG-ELISA试剂盒说明书

小鼠N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 (NAG)酶联免疫吸附测定

试剂盒

使用说明书

产品编号：E-EL-M0812

（本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断!）

声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本产品选用世界著名生产厂家的原料，采用专业ELISA kit生产技术制造。适用于体外定量检测小鼠血清、血浆、组织匀浆或细胞培养上清液中天然和重组NAG浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！如有疑问，请及时联系伊莱瑞特生物科技有限公司。

*: [96T/48T]（打开包装后请及时检查所有物品是否齐全完整）

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠NAG抗体包被于酶标板上，实验时标本或标准品中的NAG会与包被抗体结合，游离的成分被洗去。依次加入生物素化的抗小鼠NAG抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗小鼠NAG抗体与结合在包被抗体上的小鼠NAG结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下现蓝色，加终止液后变黄。用酶标仪在450nm波长处测OD值，NAG浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出标本中NAG的浓度。

标本收集:

1.血清：全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收

集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA.Na2，标本采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可

检测。避免使用溶血，高血脂标本。

3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，以去除残留血液（匀浆中裂解的红细

胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测

（具体处理方法可参考：/news2.asp?tid=477 ）

6.标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。

7.标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃/-80℃冰箱内，避免反复冻

融，1-6月内检测,4℃保存的应在1周内进行检测。

8.如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建议先

做预实验，以确定稀释倍数

)。

试验所需自备物品:

1.酶标仪(450nm波长滤光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒温箱, 双蒸水或去离子水

4.吸水纸

检测前准备工作:

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有

结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液应为室温）。

3.标准品: 加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，静置10分钟，待其充分溶解后，轻

轻混匀(浓度为2500pg/ml)。然后根据需要进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以下浓度： 2500、1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、0 pg/ml ，样品稀释液直接作为空白孔0pg/ml。如配制1250pg/ml标准品：取0.5mL 2500pg/ml的上述标准品加入含有0.5mL样品稀释液的EP管中，混匀即可，其余浓度依此类推。

4.生物素化抗体工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多

配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)成工作浓度。当日使用。

5.酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量（以100μL/孔计），实际配制时应多配制

100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液稀释浓缩HRP酶结合物(1:100)成工作浓度。

当日使用。

标准品稀释方法图例：(以500μL/管为例，也可根据实际用量来稀释，如200μL/管)

2500 1250 625 312.5 156.2578.1339.060pg/ml 洗涤方法:

1.自动洗板机：每孔加入洗涤液350μL，注入与吸出间隔60秒。

2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，

吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。

操作步骤:

实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。

1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加

标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前15分

钟内配制），酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

3.弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约350μL/每孔，甩干并在吸水

纸上轻拍将孔内液体拍干。

4.每孔加酶结合物工作液（临用前15分钟内配制）100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

6.每孔加底物溶液(TMB)100μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右（根据实际显

色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止）。