生化实验血清醋酸纤维素膜电泳整理PPT课件
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实验三
血清醋酸纤维素
生物化学的四大研究技术：
◈电泳技术 ◈分光光度技术 ◈层析技术 ◈离心技术
电泳技术
➢带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 ➢电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性 质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移 速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯 化和制备。 ➢在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴 定蛋白质、核酸等大分子物质。
9.09
1.15
6.79%-11.39%
γ-球蛋白 A/G
17.41
2.78
1.80
0.28
11.85%-22.9% 1.24-2.36
临床意义
➢急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2 和β 球蛋白升高； ➢慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高； ➢急性炎症：α1、α2球蛋白升高； ➢慢性炎症：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高； ➢红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，γ球蛋白显著升高； ➢多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β 和γ球蛋白区带之间 出现“M”带。
试剂和耗材
试剂 巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液
材料 血清，醋酸纤维素薄膜
器材 电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板
粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。
操作步骤
1. 准备 醋酸纤维素薄膜的预处理：
将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其 漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。 待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤 纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光滑 面和粗糙面。 标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划 线即为点样线并作好标记。
×100%
2、光密度计扫描法
清蛋白 1 2
清蛋白 1 2
蛋白质类型 平均值
白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白
64.59 3.12 6.16
血清中各蛋wk.baidu.com组分的含量
标准差
3.75 0.68
正常范围 （M±2SD）
57.45%-71.73%
1.76%-4.48%
1.06
4.04%-8.28%
β-球蛋白
➢按支持物的装置形式不同分为： 水平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳
➢根据电泳物质类别不同分为： 细胞电泳，核酸电泳，蛋白质电泳等
➢按其介质的物理性状不同可分为： 凝胶电泳 粉末电泳 线丝电泳 纤维膜电泳等
血清醋酸纤维素薄膜电泳
基本原理
➢本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血 清蛋白。 ➢血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋 白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、 分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度 不同。 ➢以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。 其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、 β-及γ-球蛋白。
小结
1、本次课重要概念、原理。 2、结合基本原理和实验结果，综合分析实验 操作中存在的问题。 3、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影 响实验结果的关键因素。 4、电泳结果与临床意义。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
Kaurin Tiselius (19021971)因研究电泳和吸 附分析，特别是发现 关于血清蛋白的复杂 本质而获奖1948诺贝 尔生理医学奖。
（－）
（+）
+
----------------------------表面带负电荷 ++++++++++++++++ 带正电荷的水层
（－）
（+ ）
+
+++++++++++++++++ 表面带正电荷 --------------------------- 带负电荷的水层
用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每3-5min左 右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。 将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。
操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止 背景过深或某些区带太浅。
6、注 意 事 项
分清薄膜的点样面 注意点样样品的宽度和力度 注意薄膜放置的方向 控制染色及漂洗时间 保持良好的实验秩序
端置于负极，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平 衡5min。
打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至90100V左右，电流强度为0.4～0.6mA/cm薄膜条宽， 电泳时间40min-1h左右。点样端
1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板
4. 染色
电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中， 染色5min。 5. 漂洗
2. 点样（关键） 在薄膜的粗糙面点样。点样时，先用吸管
将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样 器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约 1~2mm。
注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏 膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 。 另外操作过程要防止指纹污染。
3. 电泳 将点样后的薄膜使粗糙面（点样面）向下，点样
电泳的影响因素：
1、影响电泳迁移率的外界因素： ❖电场强度
❖溶液的pH值 ❖溶液的离子强度
❖电渗现象 2.影响电泳迁移率的内在因素：
❖质点所带净电荷的量 ❖质点的大小和形状
电泳的分类
➢根据电泳中是否使用支持介质分为： 自由界面电泳 区带电泳
➢根据电泳系统pH是否连续分为： 连续pH电泳 不连续pH电泳
预期结果
一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五 条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋 白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
清蛋白 1 2
各蛋白组分的定量
1、洗脱法：
剪下各蛋白区带 0.02mol/L NaOH洗脱 将洗脱液用分光光度计比色
结果计算
= 每种蛋白质占总蛋
白质量的相对含量
该种蛋白管光密度读数 各管光密度读数之和
➢1809年，俄国物理学家Peиce首次发 现电泳现象；
➢1937年，Kaurin Tiselius 发明了 Tiselius电泳仪，建立了自由界面电泳， 首次证明人血清蛋白的组分；
➢1948年，Wieland和Fischer以滤纸作 为支持介质的电泳；
➢1959年，Raymond和Weintraub利用 人工合成凝胶作为介质——聚丙烯酰 胺凝胶电泳:生物大分子的“Last Check”！
血清醋酸纤维素
生物化学的四大研究技术：
◈电泳技术 ◈分光光度技术 ◈层析技术 ◈离心技术
电泳技术
➢带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 ➢电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性 质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移 速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯 化和制备。 ➢在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴 定蛋白质、核酸等大分子物质。
9.09
1.15
6.79%-11.39%
γ-球蛋白 A/G
17.41
2.78
1.80
0.28
11.85%-22.9% 1.24-2.36
临床意义
➢急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，α1、α2 和β 球蛋白升高； ➢慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，β、γ球蛋白升高； ➢急性炎症：α1、α2球蛋白升高； ➢慢性炎症：白蛋白降低、α2、γ球蛋白升高； ➢红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，γ球蛋白显著升高； ➢多发性骨髓瘤：白蛋白降低，γ球蛋白升高，β 和γ球蛋白区带之间 出现“M”带。
试剂和耗材
试剂 巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液
材料 血清，醋酸纤维素薄膜
器材 电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板
粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。
操作步骤
1. 准备 醋酸纤维素薄膜的预处理：
将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其 漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。 待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤 纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光滑 面和粗糙面。 标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划 线即为点样线并作好标记。
×100%
2、光密度计扫描法
清蛋白 1 2
清蛋白 1 2
蛋白质类型 平均值
白蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白
64.59 3.12 6.16
血清中各蛋wk.baidu.com组分的含量
标准差
3.75 0.68
正常范围 （M±2SD）
57.45%-71.73%
1.76%-4.48%
1.06
4.04%-8.28%
β-球蛋白
➢按支持物的装置形式不同分为： 水平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳
➢根据电泳物质类别不同分为： 细胞电泳，核酸电泳，蛋白质电泳等
➢按其介质的物理性状不同可分为： 凝胶电泳 粉末电泳 线丝电泳 纤维膜电泳等
血清醋酸纤维素薄膜电泳
基本原理
➢本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血 清蛋白。 ➢血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋 白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、 分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度 不同。 ➢以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在 pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。 其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为α1-、α2-、 β-及γ-球蛋白。
小结
1、本次课重要概念、原理。 2、结合基本原理和实验结果，综合分析实验 操作中存在的问题。 3、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影 响实验结果的关键因素。 4、电泳结果与临床意义。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
Kaurin Tiselius (19021971)因研究电泳和吸 附分析，特别是发现 关于血清蛋白的复杂 本质而获奖1948诺贝 尔生理医学奖。
（－）
（+）
+
----------------------------表面带负电荷 ++++++++++++++++ 带正电荷的水层
（－）
（+ ）
+
+++++++++++++++++ 表面带正电荷 --------------------------- 带负电荷的水层
用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每3-5min左 右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。 将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。
操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止 背景过深或某些区带太浅。
6、注 意 事 项
分清薄膜的点样面 注意点样样品的宽度和力度 注意薄膜放置的方向 控制染色及漂洗时间 保持良好的实验秩序
端置于负极，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平 衡5min。
打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至90100V左右，电流强度为0.4～0.6mA/cm薄膜条宽， 电泳时间40min-1h左右。点样端
1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板
4. 染色
电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中， 染色5min。 5. 漂洗
2. 点样（关键） 在薄膜的粗糙面点样。点样时，先用吸管
将3微升血清均匀地涂在点样器表面，再用点样 器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约 1~2mm。
注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏 膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 。 另外操作过程要防止指纹污染。
3. 电泳 将点样后的薄膜使粗糙面（点样面）向下，点样
电泳的影响因素：
1、影响电泳迁移率的外界因素： ❖电场强度
❖溶液的pH值 ❖溶液的离子强度
❖电渗现象 2.影响电泳迁移率的内在因素：
❖质点所带净电荷的量 ❖质点的大小和形状
电泳的分类
➢根据电泳中是否使用支持介质分为： 自由界面电泳 区带电泳
➢根据电泳系统pH是否连续分为： 连续pH电泳 不连续pH电泳
预期结果
一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五 条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋 白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。
清蛋白 1 2
各蛋白组分的定量
1、洗脱法：
剪下各蛋白区带 0.02mol/L NaOH洗脱 将洗脱液用分光光度计比色
结果计算
= 每种蛋白质占总蛋
白质量的相对含量
该种蛋白管光密度读数 各管光密度读数之和
➢1809年，俄国物理学家Peиce首次发 现电泳现象；
➢1937年，Kaurin Tiselius 发明了 Tiselius电泳仪，建立了自由界面电泳， 首次证明人血清蛋白的组分；
➢1948年，Wieland和Fischer以滤纸作 为支持介质的电泳；
➢1959年，Raymond和Weintraub利用 人工合成凝胶作为介质——聚丙烯酰 胺凝胶电泳:生物大分子的“Last Check”！