分子生物学第七、八章

5）启动子清除，释放σ因子，RNApol变构，蠕动移出启动子区域
2. 新生RNA链的延伸 1）延伸复合体的形成，
σ因子解离引起RNApol全酶构象转变为核心酶构象，与DNA
模板结合，向下游移动。
2）转录的底物与新生RNA
底物NTP添加在RNA链3‘-OH端，不断延伸
影响新生RNA链转录延伸速度的因素： 1. RNApol来源，E.coliRNApol转录速度为17nt/s，其他细菌为12~19nt/s 2. 模板链的特殊序列（GC富集或反向重复序列产生的茎环结构） 3. 预警子的干扰
核心启动子由4个较小的元件组成：1）起始子；2)中心约位 于-33位的TATA框；3）位于TATA框上游的TF ⅡB识别元件 （BRF)；4）下游启动子元件。 其中，哺乳动物基因启动子在转录起点上游-25~-30有TATA 框，-75区域有CCAAT框，-90区域有GC框。
3. 类型Ⅲ基因启动子 类型Ⅲ基因的启动子是RNApol Ⅲ所识别的，转录基因包括 典型的类型Ⅲ基因如5S rRNA基因、tRNA基因、腺病毒 VARNA基因等。根据类型Ⅲ基因启动子所处的位置，可以 分为2种：基因内启动子和转录起点上游启动子。
7.1.1 RNA转录的一般特点
• • 转录具有选择性，只对基因组或DNA分子中编码 区进行转录，并具有时空选择性。 转录起始于模板的一个特定起点，并在特定终点 处终止，一个转录单位可以是一个基因（真核） 或多个基因（原核）。
5‘ 启动子 +1 专录区 终止子 3‘ 编码链 5‘ 模板链 5‘ 3‘
7.3.2 大肠杆菌的RNA聚合酶
催化中心
α2ββ’σω
核心酶
RNA聚合酶主要功能：
• 识别和结合DNA链上的启动子 • 能沿着DNA链蠕动并解开DNA双螺旋，转录后是双 螺旋恢复 • 能同时与局部链分离的DNA及转录产物RNA链结合 • 按DNA链的模板序列选择正确的底物NTP，以5’3‘方向催化磷酸二酯键形成，合成RNA链 • 识别转录的终止信号 • 能够与转录因子相互作用，调节转录速度 • 能在转录受到阻遏的情况下进行自身调整，借助辅 助因子，恢复和维持RNA合成
7.3 细菌的RNA聚合酶
• 7.3.1RNA聚合酶概述
• 20世纪60年代初期在微生物和动植物细胞中分离获得 • 60年代末分离纯化了它的亚基，并建立了离体反应系统 • 由此提出了：RNA聚合酶是在DNA模板的指导下，以4种核 糖核苷酸为底物，催化合成新生RNA链的酶。 • 在转录的各个阶段，如：酶结合、延伸、离开模板DNA特定 位点时，RNA聚合酶需要各种转录因子或辅助因子协助。 • 定义：转录过程中，特殊基因转录起始、终止及终止所需的 各种因子，统称为转录因子或辅助因子。
7.4.2 真核生物基因转录
1. 真核生物RNA聚合酶分类概述
2. 真核生物RNA聚合酶的亚基组分 3类RNApol都是由14~17个亚基组成的多亚基蛋白复合体， 一般特点为：1）结构复杂，比原核复杂的多；2）结构有相 似性；3）有几种共同亚基。 根据结构与功能，真核细胞的RNApol亚基分为核心亚基、 共同亚基和非必需亚基。 核心亚基：在结构与功能上与原核RNApol核心酶相关的亚 基都是酶活性所必需的，分别与ββ’和 α亚基同源。 共同亚基：存在于三类真核RNApol中，主要参与底物NTP 定位、在模板上连续滑动而不脱落、维持反应进行。 非必需亚基：尚未发现具体功能 3. 酵母RNA聚合酶Ⅱ的空间结构
7.5 真核基因转录的启动子
真核生物细胞核基因由3类不同的RNApol转录，不同的基因 启动子差异显著。基因转录调控区包括启动子区和各种调控 元件。调控元件包括增强子、沉默子和上游控制元件等顺式 作用元件，是调控因子识别与结合的部位。 1. 类型Ⅰ基因启动子 类型Ⅰ基因启动子是RNApol Ⅰ的启动子，主要控制rRNA前 体基因转录，有2个保守区域：1）核心启动子区域，位于转 录起点附近，-45~+20；2）上游启动子元件（UPE）位于156~-107之间。 2. 类型Ⅱ基因启动子 类型Ⅱ基因启动子是RNApol Ⅱ的启动子，主要启动编码蛋 白质等基因的表达，由核心启动子和上游启动子元件构成。
3. RNA转录的终止
转录的终止子：核心酶沿着DNA模板移动，遇到终止子时，核心酶停止 聚合作用。原核生物有2类终止子结构。
不依赖于ρ 因子（rho）的终止子的机制：富含G-C反向重复序列区形成发
夹结构，紧随其后有一段基因非模板链上富含4 6个连续或不连续的T序 列。 依赖于ρ 因子（rho）的终止子的机制：终止转录反应5个步骤（发夹结构 终止原理）
7.2.1 启动子的结构
细菌启动子结构有以下特征： 转录起始点、-10序列（定义）、-35序列， -10序列与-35 序列之间较严格的距离。
5’ 3’
-35框
-10框 TATAAT
+1 转录起始点
TTGACA
3’ 5’
大量研究证实，-10区与-35区之间间距为17bp时转录效率
最高，大约相隔2个螺距。
核心酶中α 亚基功能
识别UP元件并与之结合，增强转录水平
核心酶中β 与β ’亚基功能
β ：催化3‘，5’-磷酸二酯键形成 β’：与DNA模板结合
7.3.6 RNA聚合酶全酶的结构与功能
• 结构：略 • 功能: 见7.3.2
7.3.7 原核生物RNA转录过程
1. 启动子起始转录
1）RNApol全酶接触DNA分子，搜索识别特异结合位点（ σ因子识别-35） 2）RNApol全酶与启动子识别并结合，形成封闭性起始复合物（-55~+20） 3）DNA模板解链，封闭性复合物转变为开放性起始复合物（-10移动，解链） 4）酶在起始位点聚合9~10nt的转录产物，形成三元复合物
~
7.4 真核生物的RNA聚合酶及其转录
7.4.1 真核生物基因转录概述 真核基因转录比原核基因转录复杂，涉及更多的酶和蛋白因 子。 1. 真核生物基因转录的特点
1）转录单元为单顺反子 2）真核生物的RNApol高度分工 3）真核生物RNA转录除RNApol外，需要多种蛋白因子参与（转录因子） 4）真核基因调控转录的顺式元件比原核基因复杂 5）真核基因转录水平的调控以正调控为主
DNA
RNA
3‘
• 催化转录反应的酶是一类依赖于DNA的RNA聚合酶，能从头 开始RNA合成，没有3’和5‘外切活性，不具有校正和修复功 能。 • 被转录的DNA双链中只有其中一条模板链作为RNA合成的模 板。 • 转录起始由DNA分子上的启动子控制。启动子靠近转录起点， 起点的核苷酸编号向右为+1，+2…，向左为-1，-2…。 • 合成RNA的底物是4种5’-核糖三核苷酸，A\G\T\U，其中的 3‘OH与5’P聚合成磷酸二酯键，释放焦磷酸和自由能，推动 聚合反应。 • 新合成的RNA链总是以5‘-3’方向进行延伸，底物NTP总是加 到3‘-OH末端。RNA链的合成方向与模板DNA方向反平行。
基因内启动子：研究非洲爪蟾5S rRNA基因启动子序列时发 现的，已发现5S rRNA、tRNA、Alu家族基因启动子都位于 基因内部。 转录起点上游启动子：调控元件位于5‘侧翼区，有3种元件： 1）TATA框；2）近端序列元件；3）远端序列元件 7.6 类型Ⅱ基因转录的转录因子
真核生物RNApol不能单独结合于启动子上，需要依赖转录
单链病毒DNA转录
5‘ 复制 3‘
病毒DNA单链
互补链（模板链）
复制
病毒RNA单链
• 单链RNA病毒转录
5‘
翻译
3‘
正链RNA病毒
5‘
3‘ 复制
负链RNA病毒
3‘
5‘
翻译
7.1.2 原核生物与真核生物基因转录的差异
• 原核生物只有一种RNA聚合酶参与基因转录，真核生物有3种 以上RNA聚合酶负责基因转录，在细胞核内定位也不同。 • 转录产物差异很大。原核产物转录产物大多是编码序列，与蛋 白质氨基酸序列基本呈线性关系，真核生物含有内含子，成熟 RNA只占初始转录产物的一小部分。 • 真核生物转录产物会历经剪接、修饰等转录后加工成熟过程， 原核生物转录产物一般直接作为成熟RNA行使翻译模板功能。 • 原核生物转录产物mRNA为多顺反子，转录产物可直接作为蛋 白质合成模板，转录同时翻译也在进行，转录和翻译偶联。真 核生物mRNA是单顺反子，只编码一个蛋白分子或亚基。
• 原核基因启动子分为两类：
• 1. RNA聚合酶能直接识别并结合的启动子，称为核心启动子 • 2. 在RNApol结合时需要辅助因子协助，除了有RNA聚合酶 结合位点以外，还有核心启动子上游的辅助结合位点，称为 启动子上游部位，即UP元件（强启动子必需）
• 核心启动子与启动子上游部位共同构成原核基因启动子。
2. 真核基因转录的实验系统
利用特殊的实验系统，检测真核基因的转录活性和确定启动子功能区域， 从而发现与启动子结合的蛋白质因子等，常见的实验系统如下： 1）爪蟾卵母细胞系统 2）转基因系统 3）转染系统 4）体外实验系统
3. 研究真核基因转录起点的技术
1）测定转录起始位点：杂交分析，引物延伸，S1核酸酶图谱技术 2）测定相对的转录速度
因子协助。 转录因子（TF)：真核生物RNApol在转录过程中所需要的各 种蛋白质因子 转录因子分为2大类：1）通用转录因子(GTF)；2）基因特 异性转录因子
RNA聚合酶Ⅱ的转录因子一般简写：TF Ⅱ 通用转录因子仅支持本底水平转录，是所有细胞类型Ⅱ启动 子起始转录所必需的，以TF ⅡX表示（X表示发现顺序，如 A\B\C…)，目前已知至少9种GTF参与转录。 对于一个基因而言分为：1）基本转录因子；2）基本转录调 控因子 基本转录因子：广泛存在于各类细胞中的DNA结合蛋白，是 RNApol Ⅱ催化基因转录所必需的蛋白质因子，属于组成型 转录因子，如TF ⅡA， TF ⅡB， TF ⅡD…….。 其中TF ⅡD是一个含有TATA框结合蛋白和TBP偶联因子的 复合物。转录过程（了解）
7.2.2 启动子的功能
1. 2. 3. -35区能够增强启动子与聚合酶σ 因子识别作用 -10区对DNA解旋十分重要，决定着转录方向 起始位点附件的序列（约30个碱基）影响转录起始效率
上游元件
5’
3’
-60
增强子
-40
-35框 TTGACA

-10框 TATAAT
+1 转录起始点 3’ 5’
• 对于启动子研究发现，绝大多数突变能造成转录功 能明显下降，或完全抑制，这类突变称为启动子的 下降突变。下降突变会减少共同序列的相似性，或 使两个共同序列间距远离17bp。 • 能使启动子转录水平提高的突变称为上升突变。上 升突变一般都趋向于与启动子共同序列更接近，或 使两个共同序列间距接近17bp。
第七章
RNA的转录合成
7.1 RNA转录概述
• DNA是遗传信息的
载体，它通过复制
得到永存，并通过
转录生成mRNA、
翻译生成蛋白质的
过程来控制生命现
象。
• 定义：在DNA指导下的RNA合成称为转录
以DNA一条链作为模板合成RNA分子，产生与DNA模板链 互补的RNA链。 最初转录的RNA产物通常都需要经过一系列加工和修饰才
能成为成熟的RNA分子。
• 定义：RNA所携带的遗传信息可以用于指 导RNA的合成，即RNA的复制，称为逆转 录。
• 与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链 (coding strand)或称有义链(sense strand) 或正链。 • 另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的 DNA链称为模板链(template strand)或称反 义链(antisense strand)或负链。
7.2 启动子的结构与功能
• 定义：启动子是RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段 DNA序列，它含有RNA聚合酶特异结合和转录起始所需要 的保守序列位点，但其本身不被转录。
• 启动子一般位于转录起点+1的上游，启动子序列编号为负数，
其数值可以反映它在转录起点上游的距离。
+1 GUS P1681 P956 P796 P513 P323
7.3.3 T7 RNA聚合酶（了解）
7.3.4 σ因子的结构与功能
功能：识别启动子功能
有4个保守区，区域2最保守，分为abcd等4个亚区，
2d区负责识别-10区，4b亚区负责控制σ因子与-35框
结合，区域3参与核心酶与DNA结合。
7.3.5 核心聚合酶的结构与功能
核心酶是保证新生RNA链延伸聚合的核心。 核心酶的结构