第1章 遗传物质的分子结构、性质和功能

第二节 RNA的结构与功能
一、RNA的结构
RNA的一级结构 RNA的二级结构

分子内的局部双链 图tRNA
RNA的三级结构 tRNA 三叶草 倒L rRNA的高级结构 其他RNA高级结构 核酶：锤头型、发夹型等
RNA 的一级结构
RNA 的二级结构
RNA 的二级结构
二、RNA的功能
第一节 DNA的结构与功能
一、DNA的一级结构

DNA的一级结构是由4种脱氧核糖核苷酸即：腺嘌 呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶脱氧核苷酸，通过 3’，5’，—磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多 聚体。
DNA的一级结构
5’
5’ 3’
5’---------------------------3’
DNA分子量的表示方法
DNA的相对分子质量非常大，通常一个染色体 就是一个DNA分子，最大的染色体DNA可超 过108bp。 bp, base pair
b,base 那么一种生物基因组有多大呢？
C值：一个物种单 倍体的染色体所含 的DNA的量。
显花植物 鸟类 哺乳类 爬行类 两栖类 骨鱼类 软骨鱼类 棘皮类 甲壳类 昆虫类 软体动物 蠕虫类 酶菌 藻类 真菌 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 枝原体 106
（1）概念： 反义核酸是根据碱基互补的原理, 利用人工合成或细胞中天然存在的DNA或RNA 片段(或其化学修饰的衍生物)与目的靶序列核 酸结合，通过空间位阻作用或诱导RNAase活性 的降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转 运及翻译等水平上，抑制或封闭目的靶基因的 表达。 反义核酸的功能主要取决于其稳定性、生物利 用度以及与靶基因结合或反应的特性。
3. microRNA或miRNA，小RNA MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的 单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱 基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。
最早被发现的两个miRNAs——lin-4 and let-7被认为是通过 不完全互补结合到目标靶mRNA 3’非编码区端，以一种未知方 式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成。 多个果蝇miRNA也被发现和他们的目标靶mRNAs的3’非 编码区有部分同源。由于miRNA和其潜在的目标靶之间并非 完全互补，这使得通过信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位 点变得困难。 MiRNA的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的 关注热点。
第三节 核酸的分子杂交 p15
一、核酸的变性和复性 核酸的变性（denaturation）是指核酸双螺旋氢键的断 裂，变成单键并不涉及共价键的断裂。共价键的断裂 是核酸的降解.
将DNA双螺旋失去一半时的温度称为该DNA的Tm
（melting temperature）
复性（renaturation）
10 7
10 8
10 9
1010
10 11
图 10-37 不同门类生物的 C 值分布(仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig 21.1)
C值矛盾：DNA含量 与其结构和功能并不 一致，可能有的基因 种类远大于实际所需 的DNA含量。
显花植物 鸟类 哺乳类 爬行类 两栖类 骨鱼类 软骨鱼类 棘皮类 甲壳类 昆虫类 软体动物 蠕虫类 酶菌 藻类 真菌 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 枝原体 106
三、核酸探针及标记
探针probe: 是一段可以与靶核酸序列特异结合发 生相互作用的核酸序列，经过标记后可以用来检测 出靶核酸序列
探针的性质：DNA，RNA，双链或单链均可
探针的长度：从20bp到几kb都可以
探针的标记：同位素或非同位素
四、核酸分子杂交的应用
1. Southern blot 1975英国分子生物学家E.M.Southern发明的DNA 印迹方法 检测DNA 2. Northern blot 1977年 Alwine 建立Thonas 改进 的RNA 印迹方法 检测RNA 3. Western blot 以亲和或免疫反应检测蛋白的蛋白质印迹方法

2. RNA干扰作用原理
RNAi抑制基因表达方式： （1）与mRNA形成双链， 阻止蛋白与靶mRNA的 结合； （2）促使目标mRNA的 降解。
文献选读 3种不同的survivin siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的影响 第三军医大学学报 2007/22 目的观察靶向survivin的不同siRNA对EJ28细胞增殖和凋亡的 影响。 方法通过化学合成方法合成3对siRNA和1对荧光标记的阴性 对照siRNA。转染荧光标记的siRNA后,在荧光显微镜下观察 转染效率。实验分为siRNA164、siRNA167、siRNA389、阴 性对照组、脂质体对照组和细胞对照组。转染后24h、48h和 72h,MTT法检测siRNA对EJ28细胞增殖的影响,流式细胞术检 测凋亡率。 结果 靶向survivin的序列特异性siRNA均能抑制EJ28细胞的增 殖,其中以siRNA164抑制细胞的增殖能力最强(P<0.05),转染 48h后的抑制率最高[(41.32±2.54)%];转染48h后,siRNA164组 凋亡率最高[(13.20±0.25)%]。 结论 靶向survivin的RNAi技术在膀胱癌的基因治疗中可能具 有一定的价值
• 这是否意味着反义核酸药物没有发展前途了呢?
第五节 RNA干扰（RNA interference，RNAi ）
1998年诺贝尔奖 2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首 从反向的角度为基因表达调控的研究，基因的功能 分析提供了更好、更有效的手段
1.概念
概念一：正义链和反义链RNA组成的双链 RNA可有效抑制靶基因的表达，这种现象称为 RNA干扰。 概念二：RNA干扰是指在进化过程中高度保 守的、由双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解 的现象。（来自于网络 /view/206870.htm）
变性DNA在适当的条件下又可使两条彼此分开的链
自发重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。
变性DNA在缓慢冷却时可以复性，称为退火
核酸的变性和复性在基因工程中有何应用？
二、核酸分子杂交的基本原理
已经复性的DNA分子如果两条链来源不同，就 叫杂交分子 核酸的杂交（hybridization ）序列互补的单链 RNA和DNA，或DNA和DNA，或RNA和RNA， 根据碱基互补的原则，借助氢键相连而形成双 链杂交分子的过程
6. Biochip生物芯片 来源于微阵列技术(Microarray) 生物芯片：将数以万计的生物大分子探针分别固定 在微小载体表面而制成的芯片。目前有蛋白质芯 片和核酸芯片两类。 原理:核酸或蛋白质之间的杂交
第四节 反义核酸及药物p18
1. 反义核酸(antisense nucleic acid)


mRNA tRNA rRNA 细菌rRNA有5S、16S、23S三种；
哺乳动物rRNA有5S、5.8S、18S、28S四种

sRNA
• snRNA 核小RNA • scRNA 胞浆RNA 通常与蛋白质结合形成核糖核蛋白 颗粒（RNP），U-snRNP

对基因表达和细胞功能有调节功能的RNA
• miRNA • RNAi RNA干扰
拓扑异构酶

DNA的拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶 (topoisomerase)来实现的。
四、Triplex（三股螺旋）
Hoogsteen于1963年描述了三 股螺旋结构。

第三股碱基可与Watson-Crick 碱基对中的嘌呤碱形成 Hoogsteen配对； 第三股与寡嘌呤核苷酸之间同 向平行； 第三股可来自分子间也可来自 分子内。
Southern Blot
4. hybridization in situ 原位杂交 在组织或细胞水平上使用标记探针与细胞内 DNA或RNA杂交的方法
5.其他形式的杂交 如斑点杂交,狭缝杂交,菌落杂交,噬菌斑杂交, 本质还是Southern or Northern blot
1998年世界十大科技进展之一
Z-DNA
7
0.37
大沟平坦 小沟很窄，深
12
左
关于DNA双螺旋的小沟和大沟
大沟 宽 小沟 窄
蛋白质的alpha螺旋
说明：
1.B-DNA是活性最高的DNA构象，B变成A仍有活性，
但变成Z，活性明显降低。 2.双螺旋是动态的平衡，结构改变以适应行使不同的 功能。
三、DNA的三级结构
DNA三级结构是指DNA分子通过扭曲和折叠 所形成的特定构象。包括不同二级结构单元
间的相互作用、单链与二级结构单元间的相
互作用及DNA的拓扑特征。 超螺旋是三级结构的一种形式。
拓扑结构 见p9


就是指在DNA双螺旋的结构基础上，DNA进异步扭曲 形成的特定的空间结构。超螺旋是其主要的形式。超 螺旋又有正和负之分。 负超螺DNA易于解链。 DNA的复制、重组和转录等过 程都需将两条链解开，因此负超螺旋有利于这些功能 的进行，但这些过程需要的需要的负超螺旋程度是各 不相同的，可以通过DNA的拓扑结构来调节其功能
20年来,反义核酸药物的发展非常缓慢,仅有一个反义 药物进入市场,惟一获得批准的RNA反义药物是1998 年8月27日得到美国FDA正式批准的诺华、Isis制药的 福米韦生（fomivirsen、Vitravene），该药主要用来 治疗艾滋病人的巨细胞病毒性视网膜炎。 其他大部分都在Ⅲ期临床试验中遭遇失败,有关反义新 药的申请也很快被FDA驳回。 人们开始把目光投向竞争RNA技术平台尤其是小干扰 RNA(siRNA)。
第一章 核酸的分子结构、性质和功能
第一节 DNA的结构与功能 第二节 RNA的结构与功能 第三节 核酸的分子杂交 第四节 反义核酸及药物 第五节 RNA干扰
1869年，F.Miescher从 脓细胞中提取到一种 富含磷元素的酸性化
合物。
称核素(nuclein)
一、核酸的种类和分布 核酸有两大类：DNA 和RNA DNA分布的主要场所：细胞核，线粒体，叶绿体 RNA分布的主要场所：细胞核，细胞质 细胞生物中DNA 和RNA 均有 病毒体内则只含有DNA 或RNA 二、核酸是主要的遗传物质 历史经典实验证明遗传物质是DNA而不是蛋白质 • 1928年 Griffith 肺炎球菌转化实验 • 1943年Avery离体条件下完成转化 • 1952年Hershey Chase噬菌体转导实验
10 7
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图 10-37 不同门类生物的 C 值分布(仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig 21.1)
基因组大小实际上就是它的C值
为了阐明生物的遗传信息，首先要测定生物基因组的序列。
迄今已经测定基因组序列的生物数以百计，其中包括病 毒、大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和拟南芥菜、玉米、
（2）.反义核酸作用的靶区域
mRNA5’非翻译区 mRNA5’编码区 mRNA5’帽子形成位点区域 前体mRNA外显子与内含子结合部位 mRNA polyA形成位点区域 阻止mRNA的成熟及其向胞浆中的转运
2.反义技术与药物
反义技术是利用人工合成或细胞中天然存在 的DNA或RNA片段(或其衍生物)与特定的基 因相互作用,从而抑制基因的表达。目前发 展到第三代。 第一代 硫代修饰寡聚核苷酸 第二代 甲氧/乙氧基反义寡核苷酸 第三代 肽核酸（PNA）
水稻和人类基因组。
Genome size
Gene number
二、DNA的二级结构
DNA的二级结构就是指两条脱氧核苷酸链反向平行 排列所形成的双螺旋结构 右手螺旋，A-DNA、B-DNA、 C-DNA、 D-DNA 左手螺旋，Z-DNA
不同螺旋形式DNA分子主要参数比较：
双螺旋 A-DNA B-DNA 碱基倾角/o 20 6 碱基间距 大沟和小沟 /nm 0.26 0.34 大沟窄，很深 小沟很宽，浅 大沟宽，深 小沟窄，很深 每轮碱 螺旋方 基数 向 11 10 右 右