6.发酵工业种子的制备

酶活等
无污染
第二节 影响种子质量的因素
原材料质量 培养温度 湿度 通气与搅拌 斜面冷藏时间 培养基 pH
原材料质量
原材料质量波动引起种子质量不稳定 原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不 同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形 成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）
二、种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数
级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子
罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少
因种子罐生长异常而造成的发酵波动
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般2-4级
确定方法
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性) 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度 发酵罐中种子培养液的最低接种量 种子罐与发酵罐的容积比 随产物的品种及生产规模而定 随着工艺条件的改变作适当的调整
提高了设备利用率
节约发酵培养的动力消耗
有利于减少染菌机会
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响
5、种子的质量要求
量：要求达到一定的浓度 质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH
发酵工业的种子制备
种子制备原理与技术 影响种子质量的因素 种子质量的控制措施 种子制备放大技术实例
种子制备原理与技术
一、概述 二、种子罐级数的确定 三、种子质量的判断方法 四、种子制备技术概要
一、概述
种子培养的概念
是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态
的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶或
提供适宜的生长环境 种子无杂菌检查，保证纯种发酵
种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、 pH变化、溶氧变化、色泽和气味等。
第四节 种子制备放大技术实例
一、细菌发酵种子扩大培养 二、酵母发酵种子扩大培养 三、丝状真菌发酵种子扩大培养 四、放线菌发酵种子扩大培养 五、谷氨酸生产种子制备 六、青霉素生产种子制备
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子
培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆
培养条件：27℃，40小时
接种量：200亿孢子/吨
目的：长菌体
4、二级种子
培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
种子的质量要求
培养基
培养种子的目的：
扩大培养，增加细胞数量 同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了 使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长
种子培养基特点：
有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和 生长因子，无机氮源比例大
各种营养物质的浓度不必太高
供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源 和氮源
一、细菌发酵种子扩大培养
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为 了获得大量的活力强的种子 种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含 大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序
二、酵母发酵种子扩大培养
酿酒酵母的种子扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁 殖流程，他将每一步的接种量规定为10％， 并控制繁殖条件与酿造时一致 现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的 条件也与酿造时不同
三、种子质量的判断方法
通常检测的培养液中参数
pH是否在种子要求的范围之内 糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染
其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾 气等
四、种子制备技术概要
步骤：
斜面培养基中活化； 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实 验室种子制备 一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级
菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅速，可用固体 培养基培养孢子 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇瓶液体培养法 不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度下活化即可
培养基选择的原则
在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般
比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原
料一般都比较精细。
2、起始接种物的传代问题
细菌
保藏斜面 → 活化斜面
产孢子
保藏 → 母斜面 → 子斜面
目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。
所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。 子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单
三、丝状真菌发酵种子扩大培养
利用菌丝体作为接种物
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物， 如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉 问题：难以获得均一的接种物 接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它 具有大量的生长点
四、放线菌发酵种子扩大培养
斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子 可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子
以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依据
接种量的大小直接影响发酵周期
4、种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子
罐或发酵罐时的培养时间。
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对 较大，但是最终由实验结果定。
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了发酵周期，
五、谷氨酸生产种子制备
制备过程
斜面菌种 → 一级种子培养 → 二级种子培养
→ 发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
通气与搅拌
足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种 子的质量
搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅 拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化 变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗
丝状微生物不宜剧烈搅拌
斜面冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月 后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％，比冷藏 3个月的降低35％。
应考虑与发酵培养基的主要成分相近
pH
选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长 速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵 培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境
第三节 种子质量的控制措施
菌种稳定性的检查
测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对 退化菌种进行复壮
培养温度
温度过低，菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提 前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
湿 度
湿度低，孢子生长快 湿度大，孢子生长慢
制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现， 在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得 较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状， 孢子稀少。
在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接 近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
2、发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵 青霉素：三级发酵
一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
→ 二级种子
→ 发酵
1、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵 。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
• 种子罐级数的意义：
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，
并可减少移种带来染菌机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时
间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时
间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数
培养物可分为两类：

对于不产孢子和芽孢的微生物
——获得一定数量和质量的菌体

对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子
——菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定 的种子，但操作繁琐。
获得一定数量和质量的菌丝体
——便于操作，但需要更仔细的控制。
Leabharlann Baidu 1、培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培 养基应该是有利于孢子的生长。
2、一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1% 培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250 mL, 32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基
本接近于发酵培养基
3、二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代
扁瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量
和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
15L种子发酵罐
300L啤酒发酵罐
种子扩大培养的目的
接种量的需要
菌种的驯化；
缩短发酵时间、保证生产水平
优良种子应具备的条件
生长活力强，延迟期短；
生理状态稳定；
浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
实验室准备阶段
放罐，后处理
生 产 车 间 阶 段
产品
种子扩大培养的原因 工业生产规模的增大 种子的扩大培养
需要种子就增多
种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮 的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接 种数量足够的、纯的培养物。
菌种的活化与种子的扩大培养的区别？
（二）实验室种子制备阶段
目的：将种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的
替，浓度为2.5% 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/mL
大小均匀，呈单个或八字排列 pH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2
活力旺盛
五、青霉素生产种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子
菌落
②接种时密一点，得到大量的孢子。
孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月
（三）生产车间种子制备阶段
在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量 的菌丝体。 菌丝体比孢子要有利：

缩短发酵时间

有利于获得好的发酵结果
1、培养基选择的原则
培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌
体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。
面包酵母的种子扩大培养
三、丝状真菌发酵种子扩大培养
利用孢子作为接种物
在固化的培养基上产生孢子 “滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产 在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子
在液体深层培养基中产生孢子
灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气 条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％（w/v）之间 时，可以产生大量的孢子
不宜过少。
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一
般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要
的一个方面
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量 ＝ ————————— 接种后培养液的体积 接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，衰老细胞增加等， 发酵后劲不足 种量过少延长发酵周期，形成异常形态，而且易造成染菌
数，完成生产车间种子制备；
种子转种至发酵罐
（一）种子制备过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇
床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌
种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段
的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在
工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为 生产车间阶段。