细胞内游离钙浓度测定
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细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定
按经典方法,以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA,能以1:1的比例特异性地与Ca2+结合,与EGTA 不同的是Fura-2可发出荧光,并且结合Ca2+后荧光特性有改变,Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm,这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物,不能进入细胞内,但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强,又消除了负电荷,容易通过细胞膜,随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2,与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且,Fura-2与Ca2+解离容易,随着游离Ca2+的增加或减少,其荧光强度便随之变化。因此,Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系,据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。
Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂,与Fura-2/AM类似,Fluo-3/AM进入细胞后,酯基被水解掉,Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合,因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。但优于Fura-2/AM的是,Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍,避免了自发荧光的干扰,因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。此外,Fluo-3与Ca2+亲和力低,易解离,适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发,激发波长为488 nm,可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。
图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理
a,代表一个细胞模型;b,Ca2+荧光探针的负载;
c,Ca2+荧光探针去酯化;d,去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。
Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.
[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000),并作适当的改进。具体过程如下:
1 Ca2+荧光探针负载
1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次,加入适量的Fura-2/AM或Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%),避光,37℃恒温轻轻振荡,孵育45 min。
2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次,Hanks液清洗一次,以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。
3. 按上所述,向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液,室温放置20 min,按实验设计作相应检测。
2 Ca2+荧光强度的测定
2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i
1.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为:
激发光光栅5 nm,发射光光栅10 nm,测定温度为(37±1)℃。
2.取一定量(1×106个细胞)负载Fura-2/AM的细胞悬液,加入到测量用荧光杯中,在
上述测定条件下,以激发光波长300 ~ 450 nm,发射光波长500 nm进行扫描,检
查荧光峰值达最高时的激发波长,判断细胞负载情况,以峰值在340 nm左右处为
最佳负载状态。
3.将测定方式转换为改变波长的时间扫描(波长变换间隔为2秒),按以上参数执行双
波长测定。
4.测定最大荧光比值(R max)和最小荧光比值(R min):加破膜剂Triton X-100(终浓度为
0.1%),使Fura-2和Ca2+结合达饱和时,测得的F340/F380为R max;加入高浓度的Ca2+
螯合剂EGTA(终浓度为5 mM, pH8.5),以充分螯合Ca2+,使Fura-2游离,测得的
F340/F380为R min。
2.2 激光共聚焦显微镜测定[Ca2+]i
1.对于1组实验中的细胞,直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上,以488 nm
的氩激光激发Fluo-3产生绿色荧光,观察各皿中细胞的形态、细胞中Ca2+的荧光
强度及分布变化,拍照。
2.对于其他组的细胞样品,置激光共聚焦显微镜的载物台上,连续动态扫描选定细
胞内Ca2+荧光强度的变化。激发波长为488 nm,发射波长为515 nm,采样频率为
488 Hz, 每隔20 sec扫描一次。细胞内Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分
析处理,得到细胞内Ca2+ 变化(相对荧光强度值)的时间~ 效应曲线,再转换为时
间~ [Ca2+]i曲线。
激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性,每实验组先后重复3次,结果重复性良好。
2.3 [Ca2+]i的计算
根据Grynkiewicz, G.等(1985)提出的经典公式计算细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)的浓度。
Fura-2/AM检测的[Ca2+]i计算公式为:
[Ca2+]i = K d[(R-R min)/(R max-R)](F min/F max)
其中,K d为Fura-2与Ca2+反应的解离常数,为224 nM;R为各测定点F340/F380荧光强度比值;R max、R min分别为上述测定的最大和最小荧光比值;F min、F max分别代表Ca2+为零及饱和时,在380 nm激发光下测得的Fura-2荧光强度(F380)。实际计算由日立F-3000钙测定系统钙定量软件自动求出。
Fluo-3/AM检测的[Ca2+]i计算公式为:
[Ca2+]i = K d[(F-F min)/(F max-F)]
其中,K d为Fluo-3的解离常数,为400 nM;F为对样品检测得到的荧光强度值,F max、F min 分别为加0.1% Triton X-100及5 mM EGTA 时测得的荧光强度值。