疟疾实验技术

(5) 肝细胞内期：复发、潜伏期有关。 (6) 迟发型子孢子在肝细胞内的发育是 复发的根源。 (7) 间日疟和卵形疟有复发，恶性疟和 三日疟无复发。 (8) 裂殖子经3-6代增殖后发育成雌雄配 子体时，具有传染性。 (9) 人为中间宿主，蚊为终宿主。
疟疾检测技术
疟疾常用诊断方法
病原学诊断 免疫学诊断 分子生物学诊断
间日疟原虫 恶性疟原虫
小滋养体
较大。核1个，较大，胞浆较 （环状体） 厚。常呈"！"或"，"状。
较小。核1～2个，较小，胞浆纤 细。常呈"！"、"飞鸟"、"Ｖ"和" 断环"状。
大滋养体
较大。呈阿米巴样，形状不规 则。核位于胞浆之中或外边， 较小。常呈圆形，色素细小或结 胞浆常缩成圆形或断裂成数块。成1～2个团块。 色素分布不匀。 较大。裂殖子较大，12～24个。较小；裂殖子较小，8～26个。 较大。圆形，色素粗大。雌配 子体较大，核小，胞浆深蓝色，雌配子体新月形，雄配子体腊肠 雄配子体较小，核大，胞浆浅 形。 蓝色。
裂殖体
配子体
色素 被寄生
黄褐色，颗粒细小，结成团块后， 黄褐色，细小。杆状，或结成 呈黑褐色。配子体色素粗大，分 粗大颗粒。分布不匀。 布于核周围。
PBS缓冲液的配制（0.01 mol/l PBS pH7.2） KH2PO4 0.38g
Na2HPO4
NaCl
1.02g
8.00g
(或Na2HPO4 · 12H2O 2.58g) 蒸馏水加至 1000ml
（三）染色方法
• • • 可用吉氏或瑞氏染色法染色。 国家推荐使用吉氏染色法。 根据临床工作的实际情况，为了方 便操作，推荐使用瑞氏-吉姆萨染液 （临床用于血常规推片染色）。
中间宿主（人） 终宿主（蚊）
在蚊体内的发育阶段
肝细胞内的发育
四种疟疾均可
间日疟、卵型疟
红细胞内的发育
疟原虫完整生活史
疟原虫的生活史应明确以下几点:
(1) 当疟原虫在人体肝细胞和红细胞内增殖 时，临床上无明显表现。 (2) RBC内期：周期性发作有关。 (3) 周期性发作：一部分裂殖子再侵入红细 胞内增殖后再释放入血。 (4) 红细胞破坏，大量裂殖子、疟色素及代 谢产物释放入血，引起疟疾发作。
将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘 油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中， 再用甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒 入瓶中，摇匀后，置室温下，每天摇 动5min，3d后即可使用。
（二）染色用水
为使血膜着色较好，应用pH7 . 0 ~7 . 2 水效果最佳。常用的是中性的蒸馏 水或经煮沸过滤的冷开水。最好配制 缓冲液用于染液的稀释和染色后的冲 洗。常用磷酸盐缓冲液。
采血时间：间日疟发作后8-10小时， 恶 性疟发作2小时。
（三）涂制血膜
取玻片2 张，1 张作载片，1 张作 推片（具有光滑边缘）。
薄血膜 厚血膜
厚血膜：用右手拇指和食指夹持推片侧缘中部， 用推片的左下角刮取血液4~5ul （相当于火柴头大小），使血滴与载玻片接触， 由里向外一个方向旋转2~4圈，涂成直径0.8~1 厘米大小圆形厚血膜（厚度以1 个油镜视野内可 见到5~10 个白细胞为宜）
大滋养体
较大；核多见 1 个；胞浆阿米巴样， 较小；核 1 或 2 个；胞浆圆形，空泡 含空泡；色素黄褐色，细小，杆状，不显著；色素黄褐色，细小，结成 散在分布多见。 团块后，呈黑褐色。
未成熟裂 较大；核；胞浆圆形或不规则，空 较小；核 2 个以上胞浆圆形，空泡消 殖体 泡消失；色素黄褐色，分布不匀。 失；色素黑褐色团块状。 成熟裂殖 大于正常红细胞 ；裂殖子较大， 小于正常红细胞；裂殖子较小， 8 ～ 体 2 ～ 24 个；排列不规则；色素黄褐 26 个，排列不规则；色素为黑褐色 色，常聚集一侧。 团块。 雌配子体 大于正常红细胞，圆形；核 1 个， 较大，新月形，两端尖锐；核 1 个， 较小，深红色，位于一侧；胞浆深 较小，深红色，位于中央；胞浆深 蓝色；色素黄褐色，均匀散在。 蓝色；色素黑褐色，紧密分布于核 周围。
血膜的染色
（一）染色液的种类及配制
• 吉氏染液
保存时间长，染色时间长 • 瑞氏染液
保存时间短，染色时间短
吉氏（Giemsa’s）染液配制
吉氏粉 5.0 g 甲醇 250ml 甘油 250ml 将吉氏粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨， 然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞 玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部 分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中， 至甲醇洗清研钵中甘油为止。塞紧瓶塞，充分摇 匀，置室温内，每天用力摇动溶液5min，3d后即 可使用。
被疟原虫寄生的RBC变化
虫种 间日疟 恶性疟 RBC大小 胀大 正常或缩小 RBC颜色 变淡 正常
间日疟环状体形态
• 约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红 细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。
间日疟大滋养体形态
• 虫体增大，胞质增多，伸出伪足。 • 出现黄褐色的疟色素。 • 红细胞胀大，变形，颜色变淡，并出现数量 较多，淡红色的小点，称薛氏小点
恶性疟配子体形态
雄（小）配子体：腊肠形， 两端钝圆。胞浆浅蓝色或 淡紫红色。核较大，疏松， 位于中央，浅红色，核周 可见不染色带。疟色素松 散分布于核周围。
雌（大）配子体：新月形，两 端稍尖。胞浆深蓝色。核较小 ，致密，深红色，位于中央， 核周可见透明不染色带。疟色 素密布于核的周围。
间日疟、恶性疟厚血膜中形态特点
推荐染色方法
• 由于瑞氏-吉姆萨染液中含有甲醇，因 此在操作时，与瑞氏染液染色方法相 同。 • 应该在厚血膜完全干燥后，用蒸馏水 或清水溶血，然后再进行染色。 • 染色方法可参照产品说明书。
四、影响血膜染色质量的因素
血片染色好坏，除与玻片的清洁程度、 血膜制作的质量和染色技术等有关外， 还与下列因素有关：
• 染剂和溶剂的质量（分析纯、容器无水、 试染） • 染液的新旧 （染色前1~2周配制，越久越 好） • 染液的稀释浓度
浓 ——着色快，各种细胞着色深，薛氏 点、 茂氏点等粗大显著 。
稀 ——染液浓度低，着色慢，但各种细 胞内部结构着色均匀、清晰，但薛氏点、
• 稀释和冲洗用水（pH7.0~7.2 ） 太蓝——水pH值偏碱，用pH较低的缓冲水冲 洗； 太红——水pH值偏酸，用pH较高的缓冲液冲 洗； 偏酸 太深——建议延长冲洗时间。
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也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃 瓶中放入约50个玻璃珠（直径3 ~5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶 中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇 缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧 瓶塞，置于室温内，每天用力摇动 5min，3d后即可使用。
瑞氏（Wright’s）染液
瑞氏染剂粉 1.0 g 甘油 15ml 甲醇 500ml
疟疾检测技术及进展
疟疾：是由按蚊叮咬传播疟原虫
而引起的寄生虫病，以寒战、高 热、大汗为特点。
病 原
疟原虫是疟疾的病原体。 人体疟原虫有4种： 恶性疟原虫 （临床表现重） 间日疟原虫 （可复发） 三日疟原虫 （可复发） 卵形疟原虫
人体寄生的四种疟原虫
生活史
• 两阶段 有性生殖（蚊体内） 无性生殖（人体内） • 两宿主
（四）厚、薄血膜的位置
标签
疟疾临床 病人血膜 厚血膜血量适宜， 不宜过多或过少。 薄血膜平整,无皱 折和空泡，红细胞 单层排列。
（五）制作血片的注意事项
• 血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细胞 沉在一边，可使厚薄不匀。 • 制成的血膜须完全干燥后，方可进行固定及染色。 否则薄血膜中的红细胞边缘皱缩，厚血膜容易在 染色时脱落，而常现网状的背景； • 血膜放置时间，夏天不宜超过48 小时，冬天不宜 超过72 小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血， 影响镜检。
间日疟成熟裂殖体形态
红细胞： 胀大，褪色， 可见薛氏小点。 大 小： 个体较大。 胞浆和核：裂殖子 12~24个平均16个， 排列不规则，核红色， 胞浆浅兰色。 色 素： 黄褐色常集 于疟原虫的一边。
间日疟配子体形态
雌配子体：虫体较大，占满胀 大的红细胞。胞质致密，色深 蓝核，小致密，深红色，多位 于虫体一侧，疟色素分散 雄配子体：虫体较小，占满胀 大的红细胞。胞质浅蓝；核大 疏松，淡红色，多位于虫体的 中央。疟色素分散
一、病原学诊断—血膜镜检法 （金标准） 血片的制作
血膜染色 血片镜检
血片的制作
（一）所需设备
1．载玻片：玻片使用前应清洗。 新玻片应先浸入有液态洗涤剂的 清水中10~20 分钟，然后用干净棉巾 逐个擦拭，再用清水冲洗干净，晾干， 最后用干净柔软的棉巾将玻片擦亮。 也可以用95%乙醇浸泡。
吉氏染色（主要成分：水）
• 吉氏染液要现用现配，配制好的染液保存
不超过24小时。染液工作浓度为 2％（ 2ml吉氏原 液+98ml蒸馏水缓冲液混匀）。 • 先用甲醇固定薄血膜。 • 厚血膜如果放置时间超过48小时，需要用 蒸馏水或清水溶血。
•
取吉氏染液工作液滴在厚、薄血 膜上，20~30min后，水洗、晾干。
间日疟大滋养体与配子体的区别
虫体 胞浆 核 色素
大滋养体 较小 边缘不规则可见空泡
较小、不规则 较少、分布不匀
配子体 较大 边缘规则无空 泡 较大有不染色 带 色素分布均匀
恶性疟环状体形态
• 虫体：约占RBC的1/5-1/6,环状。常见几 个虫同时寄生在同一细胞 • 核： 小致密规则、常见2个核 • 胞浆：纤细完整
2．采血针：使用一次性采血针。 3．玻片盒：为防止污染和苍蝇吸食血膜，新制作
的血膜应放在玻片盒中，厚血膜放置时要保持水平，
直到充分干燥。
4．75 ％乙醇棉球：用于采血前后的消毒。
5．记号笔：用于玻片上书写号码。
（二）采血部位及取血方法
采血部位：末梢血（耳垂、指端） 也可使用血常规抗凝静脉血，但制作 的血片厚血膜容易脱落。
瑞氏染色（主要成分：甲醇）
• 厚血膜需要用蒸馏水或清水溶血。（用蜡笔在厚、 薄血膜间划一界限）
• 在薄血膜上滴加6~7滴瑞氏染液，轻轻摇动玻片， 使染液在血膜上展开30秒钟，加蒸馏水或缓冲液 10~12滴，摇动玻片，使染液与水充分混合，并将 染液引到厚血膜上，使厚薄血膜同时染色5分钟， 然后用蒸馏水或缓冲液将血膜冲洗干净，晾干后 检查。
血细胞形态 红细胞
中性粒细胞 中性粒细胞
血小板
淋巴细胞
嗜酸性粒细胞 单核细胞
人 体 四 种 疟 原 虫 红 内 期 各 期 形 态
环状体
大滋养体
裂殖前期
成熟裂殖体
雄配子体
雌配子体wenku.baidu.com
间日疟、恶性疟薄血膜中形态特点
间日疟原虫 恶性疟原虫
被寄生红 胀大；颜色褪色；出现薛氏点，红 大小正常，颜色正常或稍紫；茂氏 细胞 色，细小数多。 点红色，粗大数少。 小滋养体 (环状体) 较大，约占红细胞直径的 1/3；核1 小环状体较小，约占红细胞直径 1/6, 个；胞浆较薄；无色素。 大环状体与间日疟原虫相似；核 1 或 2 个；胞浆小环状体纤细，大环状体 与间日疟原虫相似；无色素。
• 间日疟镜下可见：环状体、滋养体、 裂殖 体、配子体 • 恶性疟镜下可见：环状体、配子体
厚、薄血膜镜检示意图
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• 着色较好的血膜，红细胞呈淡红色， 嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红色，嗜中性 粒细胞核呈紫蓝色，淋巴细胞及疟原 虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈 红色。除环状体外，其他各期均可查 见疟色素。以查完整个厚血膜，未查 见疟原虫者判为阴性。根据疟原虫形 态确定恶性疟、间日疟、三日疟、卵 形疟或混合感染。
标准
偏碱
• 染色时间及温度 染色时间长，效果好 ；温度高，着色快 。 • 冲洗方法 染色后不要直接将染液倒掉，应沿玻片 及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻 轻冲洗，以免染液色素颗粒沾污血膜。
血涂片检查
在染色后的血膜上加一滴香柏油， 用光学显微镜油镜检查。以检查厚血 膜为主，薄血膜主要用于虫种鉴别。
薄血膜：用推片一端中部刮取血液 1~1.5ul，将血置于载玻片离厚血膜 适当远的地方，推片下缘平抵载玻 片的中线，当血液在载玻片与推片 之间向两侧扩展至约2cm 宽时，使 两玻片保持25°~35°角，从右向左 迅速向前推成舌状薄血膜。
推片技巧：将推片匀速向前，勿停顿。 涂片的厚薄取决于速度和角度： 快、大（厚） 慢、小（薄） 一张满意的血涂片应厚薄均匀，头、体、尾鲜明 尾 体 头