疟原虫检验技术

血片制作注意事项
载玻片必须清洁无油污， ● 载玻片必须清洁无油污，不然会影响血片制作 和镜检结果． 和镜检结果． 用甲醇固定薄血膜时， ● 用甲醇固定薄血膜时，甲醇不要接触到厚血膜 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。 ● 血片充分干燥后染色，清水细缓冲洗。防止厚
血膜脱落. 血膜脱落
配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒， ● 配置吉氏母液必须过滤除去杂质颗粒，有助于 提高镜检质量． 提高镜检质量．
半定量计数法
用厚血膜每个视野中所观察到疟原虫的平均数粗略 地估计出疟原虫密度。这种方法简便， 地估计出疟原虫密度。这种方法简便，缺点是计数 的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性， 的疟原虫数受血膜厚薄影响，只能定性，不宜作定 量分析。 量分析。 国内常用。此方法将密度分为6级 国内常用。此方法将密度分为 级： 1.全厚血膜查见疟原虫数在 个以内，记录实际数字 全厚血膜查见疟原虫数在10个以内 全厚血膜查见疟原虫数在 个以内， 2.全厚血膜查见疟原虫数在 个以上，但平均每个视 全厚血膜查见疟原虫数在10个以上 全厚血膜查见疟原虫数在 个以上， 野不到1个虫 记录“ 个虫， 野不到 个虫，记录“少” 3.平均每个视野 个虫，记录“＋” 平均每个视野1~5个虫，记录“ 平均每个视野 个虫 4.平均每个视野 平均每个视野6~10个虫，记录“++” 个虫， 平均每个视野 个虫 记录“ 5. 平均每个视野 平均每个视野11~100个虫，记录“+++ ” 个虫， 个虫 记录“ 6. 平均每个视野 个虫以上，记录“++++ ”。 平均每个视野100个虫以上 记录“ 个虫以上， 。
卵形疟 P.ovale
又称蛋形疟原虫,主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、东 又称蛋形疟原虫 主要分布非洲。太平洋地区、缅甸、 主要分布非洲 南亚有散在报告 在我国已基本消灭 症状与间日疟相似, 症状与间日疟相似 有复发
正确的源自文库片姿势
标准的疟疾厚薄血膜片位置
各种不同的疟疾血片涂制法： 各种不同的疟疾血片涂制法： 标准血片
门诊发热病人血片
居民普查血片
厚薄血膜的标准
●厚血膜血量适宜，不宜过多或过少 厚血膜血量适宜， 无皱折和空泡.红细胞单层排列 ●薄血膜平整,无皱折和空泡 红细胞单层排列 血膜平整 无皱折和空泡
3. 如果能见到疟原虫，但是记数 如果能见到疟原虫，但是记数10000个红细胞时却 个红细胞时却 没有感染红细胞，那么设定感染率为＜ 没有感染红细胞，那么设定感染率为＜１％
如何确定疟原虫血片为阴性
●
检查全部厚血膜未查见疟原虫
●
最少检查100个厚血膜油镜视野未查见 最少检查 个厚血膜油镜视野未查见 疟原虫
成批血片染色
将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入3%吉氏染 将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入 吉氏染 液稀释液（ 毫升吉氏原液加缓冲液或净水 毫升， 毫升吉氏原液加缓冲液或净水97毫升 液稀释液（3毫升吉氏原液加缓冲液或净水 毫升， 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色 混匀）浸没血片，同时对厚薄血膜染色30min （如染液不合标准时，得酌情增减染色时间和浓 如染液不合标准时， 度），然后用清水轻轻将染液漂洗干净，将血片标 ），然后用清水轻轻将染液漂洗干净， 然后用清水轻轻将染液漂洗干净 本（血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。 血膜面朝下）插于晾干板上晾干，包装，镜检。
红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜） 红细胞疟原虫感染密度计算（薄血膜）
薄血膜不同区域的红细胞疟原虫感染率有较大 差别， 差别，通常血膜后端和边缘部疟原虫密度常比 前半部或中央部高，所以， 前半部或中央部高，所以，镜检时不宜只检查 一个角落，应顺玻片的横轴检查。 一个角落，应顺玻片的横轴检查。选择红细胞 排列整齐密集， 排列整齐密集，无重迭的视野
镜检时， 镜检时，应当记录下所观察到的各种疟原虫 虫期，不要笼统地记录为Pv或 。 虫期，不要笼统地记录为 或Pf。
红细胞感染率计算法（薄血膜） 红细胞感染率计算法（薄血膜）
显微镜下（ 目镜Χ100油镜 选择红细胞排列整齐密集， 目镜Χ100油镜） 显微镜下（10目镜Χ100油镜）选择红细胞排列整齐密集，无重 迭的视野（ 约300红细胞 视野） 迭的视野（ 红细胞/视野） 红细胞 视野 红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 红细胞疟原虫密度按以下公式计算： 1.红细胞疟原虫感染率（%）计算 红细胞疟原虫感染率（ ） 红细胞疟原虫感染率 红细胞原虫感染率（ ） 计数的红细胞数X 红细胞原虫感染率（%）= 疟原虫数 ÷计数的红细胞数 100 2.红细胞疟原虫感染密度计算 红细胞疟原虫感染密度计算 红细胞疟原虫密度=红细胞原虫感染率 红细胞数/每微升血 红细胞原虫感染率X红细胞数 红细胞疟原虫密度 红细胞原虫感染率 红细胞数 每微升血 男性500万个 ；女性 万个/µl；女性450万个 ） 万个/µl） 万个 万个 （男性
质量好的染色 : 显微镜下核呈红色,胞浆呈蓝色 显微镜下核呈红色 胞浆呈蓝色 如果血片偏红,说明染液偏酸性 如果血片偏红 说明染液偏酸性 如果血片偏蓝,说明染液偏硷性 如果血片偏蓝 说明染液偏硷性
偏酸 外观吉氏染色血片 标准
偏碱
染色过程
血片干燥后, 血片干燥后 用甲醇固定薄血膜 血片平置于染色板上 用吸管吸取已稀释的吉氏液约2ml于厚薄血 用吸管吸取已稀释的吉氏液约 于厚薄血 膜上，染色10 膜上，染色 min 清水细缓轻轻冲去染液 置玻片于插板上， 置玻片于插板上，自然晾干
镜检技术—血片制作 镜检技术 血片制作
厚薄血膜的制作
制作血片前， 制作血片前，首先要核对患者的姓名和年龄
取血部位和血量
采血部位： 取血方法 采血部位：耳 垂或无名指， 垂或无名指，通常在耳垂 取血，先用75% 75%酒精棉球 取血，先用75%酒精棉球 消毒取血部位， 消毒取血部位，待酒精干 后，用左手拇指和食指紧 捏耳垂上方或无名指指尖， 捏耳垂上方或无名指指尖， 右手持消毒针迅速刺入皮 不宜过深或过浅。 肤，不宜过深或过浅。然 后用右手中指轻轻挤压出 血。厚血膜血量约一粒米 大小。 大小。
用推片的一角，从取血部位刮取约4微升血量 厚血膜 用推片的一角，从取血部位刮取约 微升血量 相当于火柴头大小）， ），使血滴与平置的载玻片 （相当于火柴头大小），使血滴与平置的载玻片 接触，再由里向外一个方向旋转， 接触，再由里向外一个方向旋转，转2~4圈，涂成 圈 直径0.8~1厘米大小圆形厚血膜。 厘米大小圆形厚血膜。 直径 厘米大小圆形厚血膜 薄血膜再取一小滴血 再取一小滴血.将血置于第一张玻片离厚血膜适 薄血膜再取一小滴血 将血置于第一张玻片离厚血膜适 当远的地方.将采血玻片 推片)的边缘紧贴载玻片使 将采血玻片(推片 当远的地方 将采血玻片 推片 的边缘紧贴载玻片使 血液沿边缘散开(如图示 如图示). 血液沿边缘散开 如图示
血片染色
两种染色方法: 两种染色方法
●吉氏染色法 ●瑞氏染色法
常用吉氏染色法
吉氏染液(原液 的配置 吉氏染液 原液)的配置 原液
(Azure B type) 5g 吉氏染粉 (纯) 250ml 甘油 纯 250ml 甲醇 (纯) 纯
吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨， ●吉氏粉放入研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加边磨，直 至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中， 至甘油加完，将研磨的染液倒入棕色瓶中，在 研钵中加入少 许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗， 许甲醇清洗研钵，然后倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反 复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀， 复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖，将染液充分摇匀，置于 经过滤即可使用 室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。 室内，每天晃动数分钟，存放一周后经过滤即可使用。保存 时间越长染色效果越好。 时间越长染色效果越好。 整个染色液配制时间不能少于5个小时 ●整个染色液配制时间不能少于 个小时
疟原虫密度计算
计算疟原虫密度的三种方法： 计算疟原虫密度的三种方法：
● 白细胞原虫密度计数法 ● 半定量计数法
(厚血膜 WHO) 厚血膜
(厚血膜 厚血膜) 厚血膜 薄血膜) ● 红细胞感染密度计算法 (薄血膜 薄血膜
白细胞疟原虫密度计数法
在厚血膜按视野顺序， ● 在厚血膜按视野顺序，从看到第一个疟原虫开始计 个白细胞中的疟原虫数（ 数，记录200个白细胞中的疟原虫数（可分有性体和 记录 个白细胞中的疟原虫数 无性体），如果原虫密度较低， ），如果原虫密度较低 无性体），如果原虫密度较低，可增加白细胞计数 500~ 1 000 个。 白细胞疟原虫计算公式： ● 白细胞疟原虫计算公式： 疟原虫数 ÷ 计数的白细胞数 × 患者每微升血白细 疟原虫数/µl血 胞数 = 疟原虫数 血。 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以8 ● 如果不知患者的白细胞数，则每微升血以 000个白 个白 细胞计数(国际标准 细胞计数 国际标准) 。 国际标准
疟原虫镜检技术
西双版纳州疾控中心 李鸿斌
实验室技术
分子生物学、血清学技术发展迅猛,但是 ●分子生物学、血清学技术发展迅猛 但是 确诊疟疾的“金标准” 确诊疟疾的“金标准” 仍然是血液显微 疟疾的 镜检查 显微镜检查是唯一可鉴别4种疟原虫的方 ●显微镜检查是唯一可鉴别 种疟原虫的方 法 ●厚薄血涂片的检查仍被认为是不可替代 的疟疾诊断的金标准
间日疟 P.vivax
遍布全球温带地区及大片热带地区。 ● 遍布全球温带地区及大片热带地区。在热 带非洲， 带非洲，特别是西非则很少见 间日疟原虫分布于我国大部分地区,主要是中 ● 间日疟原虫分布于我国大部分地区 主要是中 部地区 病程良性, ● 病程良性 有复发
三日疟 P.malariae
遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲， 遍及热带和亚热带地区，特别是东、西非洲，圭亚那 及印度部分地区，呈片状、 及印度部分地区，呈片状、块状分布 三日疟在我国非常少见， 三日疟在我国非常少见，只在南方广西有过散在报告 无复发
白细胞疟原虫计数法举例
中有35个疟原虫 ●假设计数200 WBC中有 个疟原虫，在不知患 假设计数 中有 个疟原虫， 者白细胞数的情况下，以每微升血 者白细胞数的情况下，以每微升血8000个白细 个白细 胞计数, 由此计算出每微升血液疟原虫密度为： 胞计数 由此计算出每微升血液疟原虫密度为 35（疟原虫数）÷200（计数的白细胞）x 8000（每 （疟原虫数） （计数的白细胞） （ 微升血白细胞数） 微升血白细胞数） =1400 / µl 答：该患者的疟原虫密度为1400 / µl。 该患者的疟原虫密度为 。
稀释吉氏原液
●原液需经缓冲液或净水稀释后，方可用 原液需经缓冲液或净水稀释后，
于厚薄血片染色。 于厚薄血片染色。
●吸取母液时，不要晃动瓶子 以免沉淀物 吸取母液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物
泛起影响染色效果. 泛起影响染色效果
吉氏染液浓度
门诊染色
操作1 快染） 量筒内量2ml缓冲液或净水，直 缓冲液或净水， 操作 （快染） 量筒内量 缓冲液或净水 接滴加吉氏原液7滴 混匀， 接滴加吉氏原液 滴，混匀，滴入待染标本的 厚薄血膜上，染色10min，清水细缓冲洗，晾 厚薄血膜上，染色 ，清水细缓冲洗， 干镜检。 干镜检。 操作2 慢染 在量筒内量2ml蒸馏水或净水， 再 慢染) 蒸馏水或净水， 操作 (慢染 在量筒内量 蒸馏水或净水 滴加吉氏原液 吉氏原液4滴 混匀，滴入待染标本上， 滴加吉氏原液 滴，混匀，滴入待染标本上， 染色30~40min。清水细缓冲洗，晾干镜检。 染色 。清水细缓冲洗，晾干镜检。
人类四种疟原虫的 基 本特征
感染人的疟原虫有四种: 感染人的疟原虫有四种
恶性疟原虫 P. falciparum 间日疟原虫 P. vivax 三日疟原虫 P. malariae 卵形疟原虫 P. ovale
恶性疟 P.falciparum
分布热带、亚热带， ● 分布热带、亚热带，是非洲的重要疾病 ● 我国流行区域为云南省和海南省 四种疟原虫中致病力最强， ● 四种疟原虫中致病力最强，无免疫力者 感染后出现急性症状,不及时治疗可危及 感染后出现急性症状 不及时治疗可危及 生命