乳酸脱氢酶活力测定

LDH可溶于水或稀盐溶液，可制备组织匀浆，经浸泡、离心，得上 清为组织提取液。LDH测定方法很多，紫外分光光度法最为简便快 速。鉴于NADH和NAD+在340nm和260nm处有各自最大吸收峰值， 因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变， 定量测定酶的含量。 本实验反应液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下加入一定量酶液， 观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，则 LDH活力越高。其活力单位定义为：在25 ℃ ，pH7.5条件下 A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中 LDH单位，定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。
（二）LDH活力测定
实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25 ℃ 水浴 中预热。取2只光径为1cm的石英比色皿，在一只比色 皿中加入0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液3ml，置紫外分 光光度计中，于340nm处调A值为0；另一只比色皿用 于测定LDH活力，依次加入2.9ml丙酮酸溶液、0.1ml NADH溶液，加盖摇匀后测定A340nm，然后加入经稀释 （20倍）的酶液10µl，立即计时，每隔0.5min测A340nm， 连续测定3min。以A对时间作图，取最初线性部分， 计算∆ A340nm/min减少值。
匀浆缓冲液：
10m mol/L pH6.5磷酸氢二钾磷酸二氢钾缓冲液。
操作方法
（一）制备肌肉匀浆 （二）LDH活力测定 （三）蛋白质含量测定 （四）数据处理
（一）制备肌肉匀浆
取瘦猪肉（或兔肉）一块除去脂肪及筋膜等，称取20g， 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L pH6.5磷酸氢 二钾-磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s， 连续3次。将匀浆液倒至烧杯中，置4℃冰箱提取过夜， 过滤后的红色液体为组织提取液，量总体积。
试剂与器材
材料：
动物的肌肉、肝、心、肾等 组织。
Hale Waihona Puke Baidu
酶活力测定试剂：
（1）0.1mol/L pH7.5 磷酸缓 冲液 (PB)100ml； （2）NADH溶液：3.5mg纯 NADH以0.1mol/L pH7.5 PB 1ml稀释。 （3）丙酮酸溶液：2.5mg丙 酮酸钠，以以0.1mol/L pH7.5 PB 29ml稀释。 试剂（2）（3）最好在临用 前配制。
乳酸脱氢酶活力测定
目的要求
（1）学习LDH活力测定原理； （2）测定动物肌肉组织提取液LDH活力 及比活力。
原理
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）广泛存在于动物、 植物及微生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化 如下反应： LDH 乳酸 +NAD+ 丙酮酸+NADH+H+ pH7.4-7.8
（三）蛋白质含量测定
将组织提取液稀释适当倍数（约1：20）， 取0.1ml按Folin-酚法测定蛋白质含量。
（四）数据处理
每毫升组织提取液中LDH活力单位：
∆ A340nm/min ×稀释倍数 LDH活力单位（U）/ml提取液=——————————————— — 酶液加入量（ 10µl ） ×10-3 提取液中LDH总活力单位= LDH活力（U）/ml ×总体积
思考题
简述用紫外分光光度计测定以NAD+为辅 酶的各种脱氢酶测定原理。
LDH比活力
总LDH活力（U） 比活力（U/mg）=———————————— 总蛋白含量（mg）
注意事项
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，应贮存在20℃ 低温冰箱中。 2、酶液的稀释度及加入量应控制A340/nm下降在0.1-0.2之 间，以减少实验误差，加入酶液后应立即计时，准确 记录每隔0.5min A340下降值。 3、NADH溶液应在临用前配制，如其纯度为75%，则应 折合到100%，增加试剂的称量。加酶液前NADH A340 控制在0.8左右。