原位杂交

原位分子杂交

原位杂交

核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。

分子生物学技术中的杂交

液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中

固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交

菌落原位杂交Colony in situ hybridization

斑点杂交Dot blot

Southern 印迹杂交

Northern 印迹杂交

原位杂交

又称原位杂交组织化学

依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子

原位杂交原理

变性(denaturation)---双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程

复性(renaturation)---变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构

退火

杂交(hybridization)---不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起

⏹探针(probe)---一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段

靶核酸分子---所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA

原位杂交基本原理

利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分

【原位杂交优点】

既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性

既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究

所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本

应用范围广

探针及其制备

探针的长度：以选择50～300bp最为适宜

（一）探针的种类与制备

➢根据标记方法不同，分为放射性探针和非放射性探针

➢原位杂交的探针分子：cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针

cDNA探针（complementary DNA）

双链cDNA探针是最常用的核酸探针

通常容易得到的cDNA探针是克隆于质粒载体中的特异cDNA分子

【制备方法】

用生物工程技术获取特异的cDNA片段

从mRNA逆转录生成cDNA→构建cDNA 文库→筛选和克隆特异cDNA 分子

特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组

•质粒转化

•质粒扩增

•质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针

【优点】

1. cDNA探针不含内含子序列, 特别适用于基因表达的研究

2. DNA探针一般较RNA探针敏感

3. 克隆于质粒载体中, 使用方便, 不需再次克隆

4. 多种标记方法, 可靠易行

5. 杂交适宜温度范围较宽, 较稳定, 不易降解

【缺点】

1. 要用凝胶电泳移除载体序列

2. 探针需变性

3. 杂交反应中可能存在自身复性

RNA探针---体外转录技术制得

一类新型的载体: 噬菌体pSP和pGEM

这类载体在多克隆位点的二侧分别带有SP6启动子和T7启动子, 在SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶作用下, 可以进行RNA转录

将外源特异cDNA片段插入多克隆位点接头处→DNA重组体→转化细菌→质粒扩增→质粒抽提→体

外转录合成RNA探针

【优点】

单链分子, 在组织内通透性好, 杂交效率比DNA探针高

RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定

通过改变外源DNA插入方向, 或选用不同的RNA聚合酶, 可转录出正义RNA链和反义RNA链

反义RNA链---又称cRNA链, 用作杂交的探针

正义RNA链---用于杂交的阴性对照

杂交体所需解链温度高, 能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤

【缺点】

1. 容易受RNA酶污染

2. 制备过程复杂

3. 杂交适宜的温度范围较宽

寡核苷酸探针

根据靶核酸序列而设计, 在DNA合成仪上用化学方法合成的短链探针

【优点】

1. 10~50bp, 在组织内通透性好

2. 单链DNA寡核苷酸, 杂交时无需变性, 无自身杂交

3. 一次合成, 可使用多时, 价格低廉

4. 对RNase不敏感, 比RNA探针更稳定, 便于操作

【缺点】

1. 与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定

2. 探针较短, 所携带的标记物较少, 特异性、敏感性都低

3. 标记方法受限制, 只能采用末端标记法

探针的标记

1. 标记物

理想的标记物应具备的条件:

标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同

标记后探针的检测方法要简便, 准确, 可靠, 重复性好

安全无害

目前常用标记物有同位素和非同位素二大类

⏹同位素标记探针: 35S, 32P, 33P 和3H

非同位素标记探针

⏹生物素: 生物素广泛的存在于动物体内

内源性生物素对杂交信号的干扰

地高辛: 半抗原, 从洋地黄植物的花和叶中提取

杂交信/噪比高, 敏感性高

非同位素标记物中的最佳选择

2. 标记方法

⏹(1) 双链cDNA探针的标记

随机引物法(random primed DNA labelling)

⏹(2) RNA探针标记---在体外转录技术中与探针制备同时完成

(3) 寡核苷酸探针标记---主要是末端标记法(end-labelling )

标记探针的纯化与检验

纯化: 将标记反应中未被结合的,即游离的标记dNTP,与掺入cDNA或cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的部分去除

纯化的方法:

普通凝胶柱层析, 离心凝胶层析, 乙醇沉淀法

检验:斑点印迹法，液闪法

原位杂交方法

(一) 探针及其标记