荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术

(一)原理

目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。

(二) 操作步骤

将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，

透析后抗体液移入小烧杯中

↓

称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)

使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO

FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG；

如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG

在10ml小烧杯中先放入抗体

↓

按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

↓

将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h

↓

用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱

↓

收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P

比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

计算:

2.87×A495

F／P＝────────

A280-0.35×A495

合适的F／P值为2～4。

(三) 试剂器材

1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。

3. PBS、DMSO

CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。

4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na

2

5. PD10柱(Sephadex G25柱)

6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等

(四) 注意事项

1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。

2. FITC-DMSO液要临用时配制。

3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。