紫外线诱导溶源菌性型大肠杆菌裂解噬菌体的实验

实验：噬菌斑的观察

一、实验目的：观察噬菌体裂解细菌的现象。

烈性噬菌体能迅速裂解细菌，而温和性噬菌体由于原噬菌体基因整合到寄主细胞的染色体基因组上，与寄主细胞同样分裂，并分配到各个子细胞中去，因此在寄主细胞中找不到噬菌体的粒子，而是以形成噬菌体的结构单元存在，称前噬菌体。这种噬菌体叫做温和性噬菌体。这种含有温和性噬菌体的细胞称作溶原性细菌。

溶原性细菌可以自发地释放噬菌体，每1代有10—2～10—5细胞发生裂解，释放出具有感染力的噬菌体。也可以通过诱异释放噬菌体。已知具有诱异能力的物理、化学因素有紫外线、电离辐射、氮芥子气、有机过氧化物、乙烯亚胺、丝裂霉素C等。在布有敏感菌株的琼脂平板上出现肉眼可见的噬菌斑。

一、材料

1、菌种：E、colik12F2gal—/λgal+/λ

带有噬菌体（λ）和缺陷型噬菌体（λdgal）,能发酵半乳糖。

E、cdi k12sgal-

不带噬菌体，不发酵半乳糖，对（λ）噬菌体敏感。

2、培养基

(1)肉汤培养基（液体）:3ml/支×3、9ml/支×10、9ml/100ml△×2

牛肉膏5克、蛋白胨10克、Nacl 5克、蒸馏水1000ml、ph7. （2）肉汤固体培养基：120ml/250ml△×1

肉汤培养基液加入2%琼脂

（3）加倍肉汤培养基液 3ml/支×2

成分相同，浓度加倍

（4）半固体培养基：5ml/支×10

肉汤培养基液中加入0.6～0.8%琼脂

3、溶液：

（1）加镁磷配缓冲液 10ml/支×1、3ml/支×2

KH2PO4 2克、K2HPO4 7克、Mgso4.H2O 0.25克、蒸馏水1000ml (2)氯仿

4、器皿：（1）培养皿φ75mm 1块φ90mm 8块

（2）移液管 1ml 20支 10ml 2支

三、方法与步骤：

1、噬菌体的诱导和裂解液的制备

(1)从供体菌E、colik12F2gal＋斜面挑取一环接种于3ml肉汤培养基中，37℃培养18个小时。取1ml接种于9ml肉汤培养液中（100ml △）继续培养4～6小时。取9ml培养液3000r、p、m离心，收集菌体。用5ml加镁磷盐缓冲液洗涤一次。

(2)加入3ml含镁离子磷酸缓冲液制成细胞悬浮液，取3ml于φ7.5cm培养皿中，在距40cm的15w紫外灯下照射10秒钟，加入加倍肉汤3ml，37℃下避光培养2～3小时（2hr15min）。

（3）移入带塞的离心管中，加入0.4ml氯仿，剧烈振荡30-60秒，静止5分钟。3500r、p、m离心15分钟，收集上清液，此即为噬菌体裂解液。

2、噬菌体效价的测定

(1)从受体菌E、colik12F2gal—斜面挑取一环接种于3ml肉汤培养基中，37℃培养18小时，取1ml培养物加到9ml/100～150ml△肉汤培养基中，继续培养6小时。

(2)用肉汤培养基，将入噬菌体裂解液稀释成10-6、10-7、10-8三个稀释度。

(3)分别取上述三个稀释度的λ噬菌体裂解液0.5ml加入到5ml半固体肉汤琼脂中(琼脂保温48℃左右），每个稀释度2支，然后迅速加入受体菌培养物，每管0.2～0.3ml，摇匀，迅速倒入已铺好肉汤固体培养基底层的平皿中，制成双层37℃过夜培养，计算菌体的效价。

3、噬菌体值(噬菌体效价)的计算

效价＝噬菌斑总数/噬菌体裂解液(ml)×平板重复数×稀释倍数(单位/毫升)

例如：吸取稀释至10万倍(10-5)的被检样品0.1ml测定三个培养皿内的噬菌斑分别为220、230、240，其噬菌职为：

噬菌值(单位/毫升)＝[(220＋230＋240)/3×0.1]×105

＝2.3×108

噬菌斑是噬菌体的一种特性，使噬菌体浸染敏感细胞后，释放子代噬菌体，通过琼脂扩散到四周细胞继续侵染引起细胞裂解而形成的空斑。