β-内酰胺酶检测方法
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3.1.2 青霉素 G 浓度的选择
0.5IU/ml 青霉素产生抑菌圈约为22mm，符合实验要求。 3.1.3 β-内酰胺酶对菌生长的影响
极高浓度 β-内酰胺酶不影响菌生长。 3.1.4 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
第一次实验结果 10天后第二次实验结果 第一次实验中，4U/mlβ-内酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml 青霉素，与对照组比较抑菌圈明显 减小。 10天后第二次实验，200U/mlβ-内酰胺酶可部分分解0.5IU/ml 青霉素，与对照组比较抑菌圈 明显减小。但4U/mlβ-内酰胺酶组产生的抑菌圈与对照组比较无明显区别。 通过第一次实验和第二次实验结果比较，说明抗生素分解剂活性下降。
同成分的10%脱脂奶（添加成分见表2），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。同时做脱
脂奶中 β-内酰胺酶的测定。
表2
编号
0.5ug/ml 青霉素 G
400U/mlβ-内酰胺酶
25ug/ml 舒巴坦
抑菌圈
与1号比直径差异
1
＋
－
wk.baidu.com
－
2
＋
－
＋
≤3mm
含 β-内酰胺酶
不含 β-内酰胺酶
3
＋
＋
－
4
＋
＋
＋
微生物方法
1 材料 1.1 菌株 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001购自国家医学菌种保藏管理 中心，在营养琼脂上传代培养备用。 1.2 培养基 营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ（低 PH）购自陆桥。 1.3 试剂 试验用10U 青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉 素 G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水 1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm） 2 方法 2.1 预试验 2.1.1 抗生素检测用培养基制备 90mm 培养皿铺10ml 抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml 藤黄微球菌）。 2.1.2 生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析 将10U 青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面，其中3片纸上滴加20ul 不同稀释 度的抗生素分解剂（500万 U/ml，50万 U/ml，5万 U/ml），同时做生理盐水和青霉素药敏纸 片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。 将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。 2.1.3 青霉素 G 浓度的选择 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 含有不同 浓度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青霉素 G 的生理盐水，37℃培养 18-22小时。测量抑菌圈直径，以确定青霉素 G 使用浓度。 2.1.4 β-内酰胺酶对菌生长的影响 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 含有不同
浓度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50万 U/ml，75万 U/ml，125万 U/ml，250万 U/ml） β-内酰胺酶的生理盐水，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。 2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有 0.5ug/ml 青霉素 G 和不同浓度 β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml） 的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。 将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。 2.1.6 脱脂奶对实验效果的影响 使用10%（w/v）脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。 2.1.7 舒巴坦浓度的选择（未完成，实验参数待验证） 有实验表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml 舒巴坦进行测试发现，含有200ug/ml 舒巴 坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈；含有25ug/ml 舒巴坦可有效抑制10%脱 脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml 青霉素 G 的分解作用。 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不 同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小 时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。 在青霉素 G 浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在每 个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有0.5ug/ml 青霉素 G、400U/mlβ-内酰胺酶（高于推荐使用浓度100倍）和不同浓度舒巴坦（0ug/ml， 25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况， 以确定舒巴坦最终适用浓度。 2.1.8 脱脂奶中 β-内酰胺酶的测定（未完成，实验参数待验证）
牛乳中非法添加 β-内酰胺酶检测方法
发布时间： 2009-5-8 浏览次数： 365 次
随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗 生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为 β- 内酰胺类药物是 治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生 素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自 己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。 2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还 没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质 量。 奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加 物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是 β-内酰胺酶，它 是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的 β- 内酰胺类抗生素。β-内 酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内 酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物 耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。 微生物方法和理化方法均利用 β-内酰胺酶能够裂解青霉素的 β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的 原理检测乳制品中是否添加解抗剂。
0.5ug/ml 青霉素、25ug/ml 舒巴坦和不同浓度 β-内酰胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）
的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.2 牛奶样品中 β-内酰胺酶的测定
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不
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结果预测
有
有
≥3mm
无 有 无 有/无
含抗生素/不含抗生素
3 实验结果与分析 3.1 预实验结果与分析 3.1.1 生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析
第一次实验 10天后第二次实验 青霉素对照 第一次实验5万 U/ml 抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小； 50万 U/ml 抗生素分解剂可以完全分解青霉素，不产生抑菌圈。 10天后第二次实验50万 U/ml 抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明 显变小。 第一次实验和第二次实验结果比较，抗生素分解剂活性下降至少1个数量级。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不
同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
表1
编号
0.5ug/ml 青霉素 G
结果预测
（是否产生抑菌圈）
400U/mlβ-内酰胺酶
25ug/ml 舒巴坦
1
＋
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有
2
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有
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无
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有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不
同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.1.9 β-内酰胺酶检测限的测定（未完成）
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有
0.5IU/ml 青霉素产生抑菌圈约为22mm，符合实验要求。 3.1.3 β-内酰胺酶对菌生长的影响
极高浓度 β-内酰胺酶不影响菌生长。 3.1.4 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
第一次实验结果 10天后第二次实验结果 第一次实验中，4U/mlβ-内酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml 青霉素，与对照组比较抑菌圈明显 减小。 10天后第二次实验，200U/mlβ-内酰胺酶可部分分解0.5IU/ml 青霉素，与对照组比较抑菌圈 明显减小。但4U/mlβ-内酰胺酶组产生的抑菌圈与对照组比较无明显区别。 通过第一次实验和第二次实验结果比较，说明抗生素分解剂活性下降。
同成分的10%脱脂奶（添加成分见表2），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。同时做脱
脂奶中 β-内酰胺酶的测定。
表2
编号
0.5ug/ml 青霉素 G
400U/mlβ-内酰胺酶
25ug/ml 舒巴坦
抑菌圈
与1号比直径差异
1
＋
－
wk.baidu.com
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2
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≤3mm
含 β-内酰胺酶
不含 β-内酰胺酶
3
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微生物方法
1 材料 1.1 菌株 藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001购自国家医学菌种保藏管理 中心，在营养琼脂上传代培养备用。 1.2 培养基 营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ（低 PH）购自陆桥。 1.3 试剂 试验用10U 青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉 素 G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水 1. 4 主要仪器 牛津杯（外径8mm） 2 方法 2.1 预试验 2.1.1 抗生素检测用培养基制备 90mm 培养皿铺10ml 抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml 藤黄微球菌）。 2.1.2 生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析 将10U 青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面，其中3片纸上滴加20ul 不同稀释 度的抗生素分解剂（500万 U/ml，50万 U/ml，5万 U/ml），同时做生理盐水和青霉素药敏纸 片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。 将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。 2.1.3 青霉素 G 浓度的选择 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 含有不同 浓度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青霉素 G 的生理盐水，37℃培养 18-22小时。测量抑菌圈直径，以确定青霉素 G 使用浓度。 2.1.4 β-内酰胺酶对菌生长的影响 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 含有不同
浓度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50万 U/ml，75万 U/ml，125万 U/ml，250万 U/ml） β-内酰胺酶的生理盐水，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。 2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有 0.5ug/ml 青霉素 G 和不同浓度 β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml） 的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。 将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。 2.1.6 脱脂奶对实验效果的影响 使用10%（w/v）脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。 2.1.7 舒巴坦浓度的选择（未完成，实验参数待验证） 有实验表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml 舒巴坦进行测试发现，含有200ug/ml 舒巴 坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈；含有25ug/ml 舒巴坦可有效抑制10%脱 脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml 青霉素 G 的分解作用。 在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不 同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小 时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。 在青霉素 G 浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在每 个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有0.5ug/ml 青霉素 G、400U/mlβ-内酰胺酶（高于推荐使用浓度100倍）和不同浓度舒巴坦（0ug/ml， 25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况， 以确定舒巴坦最终适用浓度。 2.1.8 脱脂奶中 β-内酰胺酶的测定（未完成，实验参数待验证）
牛乳中非法添加 β-内酰胺酶检测方法
发布时间： 2009-5-8 浏览次数： 365 次
随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗 生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为 β- 内酰胺类药物是 治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生 素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自 己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。 2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还 没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质 量。 奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加 物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是 β-内酰胺酶，它 是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的 β- 内酰胺类抗生素。β-内 酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内 酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物 耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。 微生物方法和理化方法均利用 β-内酰胺酶能够裂解青霉素的 β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的 原理检测乳制品中是否添加解抗剂。
0.5ug/ml 青霉素、25ug/ml 舒巴坦和不同浓度 β-内酰胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）
的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.2 牛奶样品中 β-内酰胺酶的测定
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不
5
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结果预测
有
有
≥3mm
无 有 无 有/无
含抗生素/不含抗生素
3 实验结果与分析 3.1 预实验结果与分析 3.1.1 生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析
第一次实验 10天后第二次实验 青霉素对照 第一次实验5万 U/ml 抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小； 50万 U/ml 抗生素分解剂可以完全分解青霉素，不产生抑菌圈。 10天后第二次实验50万 U/ml 抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明 显变小。 第一次实验和第二次实验结果比较，抗生素分解剂活性下降至少1个数量级。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不
同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
表1
编号
0.5ug/ml 青霉素 G
结果预测
（是否产生抑菌圈）
400U/mlβ-内酰胺酶
25ug/ml 舒巴坦
1
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有
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在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有不
同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.1.9 β-内酰胺酶检测限的测定（未完成）
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有