第二十二章 金免疫技术

第二十二章 金免疫技术
Chapter 22 colloidal gold immunoassay
第一部分 教学内容和要求
一、目的要求
·掌握：免疫金标记技术、胶体金、免疫金的概念，金免疫技术的主要类型，金免疫测定技术的类型、原理和临床应用；熟悉：金免疫组织化学染色技术的类型、原理及临床应用；了解：胶体金特性及其制备，免疫金的制备及技术要点，各检测技术方法的技术要点。

二、教学内容
1．胶体金与免疫金制备：胶体金特性及其制备，免疫金的制备。
2。金免疫测定技术：斑点金免疫渗滤试验，斑点金免疫层析试验，临床应用及评价。
3。金免疫组织化学技术：免疫金(银)光镜染色技术，免疫金电镜染色技术，临床应用与评价。

第二部分 测试题
一、选择题
（一）单项选择题（A型题）
1. 金免疫技术由Faulk和Taylor始创，最初用于
A. 金免疫电镜染色
B. 金（银）免疫光镜染色
B. 斑点金免疫渗滤试验
D. 斑点金免疫层析试验
E. 金免疫定量检测
2. 有关胶体金颗粒大小特性的正确描述
A. 胶体金颗粒越大，λmax越小
B. 胶体金溶液呈色与胶体金颗粒大小无关
C. 胶体金颗粒越大，呈色越深
D. 胶体金颗粒大小与制备时柠檬酸三钠加入量无关
E. 胶体金颗粒大小与制备时柠檬酸三钠加入量呈正比
3. 同时检定胶体金颗粒大小和均一度的方法是
A.观察胶体金溶液的颜色
B.分光光度计扫描λmax
C.扫描电镜观察
D.对流免疫电泳
E.免疫电泳
4. 在免疫金的制备原理中，胶体金与蛋白质结合力为
A.肽键结合力
B. 二硫键结合力
C. 氢键结合力
D. 静电引力
E. 疏水作用力
5. 关于胶体金保存的描述，正确是
A. 置于洁净的玻璃器皿
B. 加防腐剂不利于保存
C. 使用时为提高标记效率不必低速离心去除凝集颗粒
D. 保存过程产生少量胶体金凝集颗粒就会影响以后胶体金的标记。
E. 应于干燥处避光保存
6. 当前免疫电镜技术中应用最广的标记物
A. 辣根过氧化物酶
B. 硝酸银
C. 胶体金
D. 铁蛋白
E. FITC
7. 斑点金免疫渗滤试验间接法测血清标本中抗体,导致假阳性结果的主要原因
A. 血清标本中非目的IgG的干扰
B.血清标本中非目的抗原的干扰
C.洗涤不充分
D.反应时间过长
E．反应时间过短
8. 斑点金免疫层析试验竞争法测小分子抗原（a），层析条的待测样品结果判读处应包被
A. 胶体金标记抗a抗体

B.标准抗原（a）
C. 抗免疫金抗体
D.抗a抗体
E. 小鼠IgG
9.免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原(b)，层析条的待测样品结果判读处应包被
A. 胶体金标记抗b抗体
B. 抗b抗体
C. 抗免疫金抗体
D. 标准抗原（b）
E. 人血清IgG
10. 用于包被斑点金免疫层析试验载体膜质控条(线)的物质是
A. 抗免疫金抗体
B. 人白蛋白
C. 待测抗原标准品
D. 胶体金标记抗体
E. 胶体金颗粒
11. 关于斑点金免疫层析试验双抗体夹心法结果正确的判读
A. 仅出现一条棕红色质控条带者为试验结果阳性
B. 出现两条棕红色条带者为试验结果阳性
C. 出现棕红色质控条带者为试剂失效
D. 必需在5分钟内观察结果
E. 仅在实验区出现一条棕红色条带者为试验结果阳性
12. 关于斑点金免疫层析试验竞争法结果正确的判读
A. 仅出现一条棕红色质控条带为阴性
B. 出现两条棕红色条带为阳性
C. 无棕红色质控条带出现为试剂失效
D. 都无棕红色条带出现即为阳性
E. 出现一条棕红色条带即为阳性
13. 胶体金间接免疫层析法测血清抗体，常设计成反流免疫层析法的主要目的
A. 缩短反应时间
B. 减少样品用量
C. 提高灵敏度
D. 提高特异性
E. 减少血清中非特异性免疫球蛋白对实验结果干扰
14. 关于斑点金免疫渗滤和免疫层析实验操作，二者相同的是
A. 二者均需要胶体金标记物、洗涤液等溶液试剂
B. 所有反应都是在固相膜的一个固定区域完成
C. 反应结果的的判断，二者均不需酶促底物反应呈色
D. 所有试剂均预制在膜上
E. 两者结果判读模式一样
15. 斑点金免疫渗滤试验来源于
A. RIA
B. dot-ELISA
C.免疫层析实验
D.免疫印迹实验
E. 荧光免疫组化染色
16. 关于斑点金免疫层析实验原理正确的描述
A. 其实验的基本原理与dot-ELISA相似
B. 其实验所用的试剂均被预先固相化在滤膜上
C. 样品以横流层析通过滤纸条不同区域时，完成酶促反应
D. 实验过程须洗涤
E. 其竞争法试验结果判断以出现两条沉淀线为阳性
17. 关于斑点金固相膜免疫测定，下列错误的是
A. 可以适用于定性和定量试验
B. 其示踪物是胶体金颗粒
C. 免疫渗滤实验是利用了微孔膜的毛细管作用
D.免疫层析实验是利用了微孔膜的穿流性
E. 方法具有简便、快速、灵敏度较高的特点
18. 免疫金（银）光镜染色技术中，常用的金离子（Au+）还原剂为
A. 对苯

二酚
B. 苯酚
C. 甲醇
D. 草酸盐
E. 白磷
19. 关于免疫金银染色的描述，错误的是
A. 敏感度较单纯免疫金染色更高
B. 多用于组织化学检测
C. 利用金颗粒对银离子的还原性
D.具有定位精确的优点
E. 阳性结果为桔红色颗粒沉积
20.免疫电镜技术中，最常用的免疫染色技术
A. 酶标记抗原免疫组化技术
B. 金免疫技术
C. 荧光免疫组化技术
D. 非标记抗体酶免疫组化技术
E. 铁蛋白标记免疫技术

（二）多项选择题（X型题）
1. 关于胶体金结构和特性的正确描述
A. 包括一个基础金核
B. 颗粒大小约为1～100nm
C. 具有内正外负的双离子层
D. 对电解质敏感
E. 吸收峰波长随颗粒大小而改变
2. 免疫金制备过程中，影响蛋白质（抗原或抗体）吸附胶体金颗粒的因素有
A. 胶体金颗粒表面的粗糙程度
B. 胶体金颗粒表面带负电荷大小
C. 蛋白质的分子大小及浓度
D. 溶液pH值
E. 溶液离子强度
3. 用于制备胶体金的还原剂
A. 白磷
B. 聚乙二醇
C. 抗坏血酸
D. 枸橼酸钠
E. 鞣酸
4. 用于免疫金溶液保存的稳定剂
A. 多种蛋白质
B．葡聚糖
C．PEG2000
D．明胶
E．甲醛
5. 下列说法正确的是
A.配制胶体金溶液时，调整各试剂的比例可获大小不同的金颗粒
B.免疫金的保存常用中性的PBS或Tris缓冲液
C.制备胶体金的玻璃容器最好经硅化处理
D.蛋白质聚合物易影响胶体金标记过程
E.高分子稳定剂可减少免疫金复合物的非特异性吸附反应
6. 胶体金性能的鉴定指标有
A. 胶体金颗粒大小
B. 胶体金颗粒的均一程度
C. 胶体金颗粒有无凝集颗粒
D. 胶体金颗粒免疫活性
E. 胶体金溶液呈色
7. 关于免疫金电镜染色技术包埋后染色法的正确描述
B．结果重复性好
C．可进行多重免疫染色
D．易保持细胞膜结构完整
E．易保持抗原免疫活性
8. 斑点金免疫渗滤试验的优点
A. 操作简便、快捷
B. 操作人员不需技术培训，无需特殊仪器设备
C. 试剂稳定、易于保存
D. 符合"床边检验"项目的要求
E. 灵敏度较高，高于酶标法
9. 属于金免疫测定技术的测定方法
A. 金免疫电镜染色
B. 免疫金（银）光镜染色
C. 斑点金免疫渗滤试验
D. 斑点金免疫层析试验
E. 胶体金免疫吸附试验
10. 影响胶体金溶液稳定性的因素
A. 胶体金胶

粒间的相互吸引力
B. 水化层的带电情况
C. 胶体界面的溶剂膜
D. 共价键结合力
E. 胶体金溶液浓度

二、填空题
1. 金免疫技术主要有___________和___________，前者包括___________和___________；后者包括___________和___________等。
2. 免疫金是指___________的结合物,在免疫组织化学染色技术中，习惯上称之为___________。
3. 斑点金免疫层析试验方法学类型有___________、___________和___________。
4. 渗滤装置是斑点金免疫渗滤试验试剂盒中主要组成部分之一 ，由___________、___________和___________三部分三部分组成。
5. 斑点金免疫渗滤试验试剂盒由___________、___________和___________组成。
6. 用于电镜的免疫金法可分为___________和___________两大类。
7. 免疫金电镜染色技术包括___________、___________两个主要步骤。
8. 为了消除待测血清标本中___________的干扰，斑点金间接免疫层析法测抗体常设计成___________。

三、名词解释
1. 免疫金银染色（immunogold silver staining，IGSS）
2. 胶体金(colloidal gold)
3. 免疫金(immunogold)
4. 免疫金标记技术(gold labeled immunoassay)

四、问答题
1.何谓金免疫测定技术？简述其技术类型及原理。
2.简述免疫金电镜染色技术的原理、技术要点和注意事项。

第三部分 参考答案与题解
一、选择题
（一）单项选择题（A型题）
1.A 2.C 3.C 4.D 5.A 6.C 7.A 8.B 9.B 10.A 11.B 12.C 13.E 14.C 15.B 16.B 17.B 18.A 19.E 20.B
（二）多项选择题（X型题）
1.ABDE 2.ABCDE 3.ACDE 4.ABCD 5.ABCDE 6.ABC 7.ABC 8.ABCD 9.CDE 10.ABC

二、填空题
1.金免疫组织化学染色技术、 金免疫测定技术、 免疫金（银）光镜染色技术、 免疫金电镜染色技术、
斑点金免疫渗滤试验、 斑点金免疫层析试验
2.胶体金与抗原（抗体）、 金探针
3.双抗体夹心法、 竞争法、 间接法
4.塑料小盒、 吸水垫料、 点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片
5.渗滤装置、 胶体金标记物、 洗涤液
6.包埋前染色、 包埋后染色
7.标本包理、 免疫组化染色
8.非特异性IgG、 反流免疫层析法

三、名词解释
1.免疫金银染色：是在金免疫技术基础上发展起来的更为敏感的技术，利用金免疫技术测定产物上的金颗粒将银离子还原成银颗粒，在金颗粒表面形成一色泽更深的黑色层，可增强金免疫技术的敏感性。
2.胶体金：是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液，胶体金颗粒由一个基础金核（金原子Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。
3.免疫

金：是指胶体金与抗原（抗体）的结合物。
4.免疫金标记技术：是指利用胶体金颗粒标记特异性蛋白，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，从而进行定性或半定量检测。

四、问答题
1.金免疫测定技术是指用胶体金颗粒作为标记物进行抗原抗体反应的一类免疫学测定技术，其主要技术类型有斑点金免疫渗滤试验和斑点金免疫层析试验。
（1）斑点金免疫渗滤试验：在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
（2）斑点金免疫层析试验是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的固相膜免疫分析技术，滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如层析一般，在移动过程中被分析物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带来判读实验结果。
2.（1）原理：免疫金电镜染色技术原理是胶体金标记物与镍网上待检标本的相应蛋白质发生结合反应,由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故金标蛋白结合处，电镜下可见黑褐色颗粒，从而对细胞膜上或细胞内的蛋白质进行定性与定位。
（2）技术要点：①标本包理： 用戊二醛对标本进行固定，后行锇酸固定(固定膜结构)，丙酮或乙醇逐级脱水，包埋(Epon812树脂)，超薄切片(80nm)，置300目镍网上；②免疫组化染色：白蛋白封闭，加第一抗体，孵育，PBS冲洗，卵白蛋白封闭，加第二抗体(胶体金标记抗IgG抗体 )，孵育，PBS冲洗，蒸馏水冲洗，醋酸双氧铀、枸橼酸铅复染，电镜观察。
（3）注意事项：①以上染色步骤除清洗外，皆在滴于蜡膜（封口膜）上的各种液体小滴上进行。应注意始终保持镍网湿润，不得让任何一种液体干于网上，并要吸去镊子尖部夹起的多余液体；②用于电镜观察的免疫金法可分为包埋前染色和包埋后染色两大类，包埋后染色具有简便可靠，结果重复性好，能在同一组织切片上进行多重免疫染色的优点，但会使某些抗原失活，不易保持细胞膜结构完整。
（陶志华 杨建荣）