分子克隆工具酶及其应用

2. Omega核酸酶（I-SceI）：
由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp，其识别顺序为 5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’ TATT 3. I-PpoI：来自于Physarum polycephalum 识别序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT
六.限制酶的星反应（star activity）
1. 特点: 限制酶识别序列特异性降低 2. 发生星反应的限制酶和条件（见下页） 3. 星反应的利用和避免
表1 具有星反应的限制性内切酶与条件
限制酶 AvaI BamHI BstI BsuI EcoRI HaeⅢ HhaI HindⅢ HpaI PstI PvuⅡ SalI ScaI SstⅡ XbaI 诱发星活性的条件a 1, 2, 4 1 - 5, 8 2, 4 2, 4, 6 1, 2, 4 - 6 2, 4 2, 4, 7 6 1, 2, 4 1, 2, 4, 7 2, 4 1, 2, 4, 7 4 - 6, 8 2, 4 2, 4, 7 识别序列 G GATCN, G PuATCC
N AATTN
a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(>25U/μ g)；
5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5; 7:二甲基亚砜(8%); 8:无NaCl。
七. 其它特异性的内切酶及其用途
1. λ末端酶（λ terminase）：
5’-GGGCGGCGACCTN--3’ N--5’，出现的频率约412 分子量为 117,000 = 1 A（74,000）+ 2 Nul（21,000）
PAATTC-3’ HOG-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC 3’-GGG GGG-3’ CCC-5’
４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
a. 顺序完全重叠 如：M. ClaI（ATCGmAT）----TaqI （TCGmA） b. 顺序边界重叠 如：M. BamHI（GGATmCC）----MepI （mCCGG）
３） 抑制不同种限制酶的部分活性
M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC， GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC
第二节
DNA 甲 基 化 酶
一. 甲基化酶的种类与识别顺序
1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶
三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤 发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤：
在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制 酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。 如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 M．HpaI C mCGG HpaI C CGG 相同
三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；
狭义指II型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、
菌系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种 名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型 血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制
酶谱。
二 . 限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS
（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三 个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、 SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。 2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基因位于质粒上。 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基 因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具 有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于 基因工程中。
不同末端的连接特性: 除第4种末端不能进行不同DNA分 子或同种DNA分子不同切点产生的末端相连外，其余4种 末端可以相互连接。
五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多 种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同
KpnI SstI GGTAC C CCGC GG Asp718 G GTACC SacI CCGC GG
甲基化酶与识别序列
受甲基化影响的限制酶b AluⅠ, BamHⅡ, Bsp1286 DdeⅠ,HgiAⅠ, NheⅠ, PstⅠ BamHⅠ, MspⅠ ClaⅠ, MboⅠ, TaqⅠ
EcoRⅠ MstⅠ, PstⅠ, PvuⅡ BanⅡ,BglⅠ,Bsp1286,BstXⅠ,HaeⅢ, MspⅠ,NaeⅠ,NcoⅠ,SacⅡ, Sau96Ⅰ AhaⅡ, FnuDⅡ, HhaⅠ AhaⅡ,AvaⅠ,AvaⅡ,HpaⅡ,ScrFⅠ HinfⅠ, HphⅠ, Sau3AⅠ BamHⅠ, MspⅠ AluⅠ, PstⅠ AluI, AvaⅠ, EcoRV, HinCⅡ, HinfⅠ, MboⅠ, TaqⅠ, XmnⅠ
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点
１）识别４-8个相连的核苷酸
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 起
表2
限制酶 AvaⅡ BclⅠ ClaⅠ EcoRⅡ HphⅠ MboⅠ NruⅠ Sau96Ⅰ SauFⅠ StuⅠ TagⅠ XbaⅠ
对甲基化敏感的限制性内切酶
甲基化酶 dcm dam dam dcm dam dam dam dcm dcm dcm dam dam
识别序列* GG(A/T)CC(A/T)GG TGATCA GATCGAT CC(A/T)GG GGTGATC GATC GATCGCGA GGNCC(A/T)GG CC(A/T)GG AGGCCTGG GATCGA TCTAGATC
识别序列a
AGmCT
GGATmCC ATCGmAT GmATC c CCA/TGG c GAmATTC GCNGC GGmCC GGmCC GmCGC CmCGG TmCACC mCCGG CTGCmAG TCGmA
a.标在碱基的左上角的m表示该碱基被甲基化; b.所列出的限制酶均已商品化; c.参见表2; d.M.HI分离自噬菌体污染的细菌细胞，它可识别两个序列，GCNGC• 甲基化位点尚未确定。 的
２）富含ＧＣ
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是 ５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ 5’-CTGCA 3’-G 5’-GOH 3’-CTTAAP G-3’ ACGTC-5’
*下横线字母表示限制酶识别序列, 绿色字母表示dam甲基 化酶识别序列,红色字母表示dcm甲基化酶识别序列
2.
II型甲基化酶对限制酶活性的影响
１） 抑制同种限制酶的活性
M.BamHI GGATmCC—BamHI(GGATCC) M.EcoRI GAmATTC—EcoRI(GAATTC)
２） 抑制不同种限制酶的活性
4. 用途
遗传标记， 构建载体
八. 限制酶的用途
1. 2. 3. 4. DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切
附：IIS型限制酶的特点
1. 具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不 具有对称结构。 2. 酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位 点的一侧，1-- 20nt。 3. 酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。 4. 产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。 5. 均为单体，分子量为47—108 kD。
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 5’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(N)13
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
５）相容性末端
如：BamHI BglII MboI, Sau3AI G GATCC A GATCT N GATCN
3.
甲基化酶的用途
１） 改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成 ２） 在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然 后再用限制酶切
表3
甲基化酶
M.AluⅠ
M.BamHⅠ M.ClaⅠ dam dcm M.EcoRⅠ M.HId M.HaeⅢ M.HhaⅠ M.HpaⅡ M.HphⅠ M.MspⅠ M.PstⅠ M.TaqⅠ

第一节
限制性内切核酸酶
一
. 限制性内切酶的发现
Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I
1. 细菌限制修饰系统的发现
Βιβλιοθήκη Baidu型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现
H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血
杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
分子克隆工具酶及其应用
分子克隆工具酶及其应用
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯 化、检测等。
二. 甲基化酶活性对限制酶活性的影响
1. dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响
1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序 是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG) 边界重叠 ClaI--dam； Sau96I--dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重 叠 如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm--BstNI
上述几种限制酶产生的DNA片段仍可相连，由此形成的重组 分子能被MboI和Sau3AI识别和酶切，但BamHI和BglII的识别机率 只有1/16。
BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/A BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不 能为两种酶所识别和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C
用于基因组文库的建立
RE RE RE M.RE CH3 RE RE
RE
RE
RE
CH3 RE
RE
CH3
用于cDNA的连接
RE 甲基 化酶
2. E．coli 的dam、dcm甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制 修饰系统。 dam G mATC， dcm C mCA/TGG
3. 哺乳动物的甲基化酶
该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与 DNA复制、基因转录等过程有关。
4. E．coli中依赖于甲基化的限制修饰系统 mrr（mA/A）、mcr(Am5CG)、merB（Pum5C）