基因工程的工具酶
基因工程常用的工具酶
2024/10/14
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6
识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
2024/10/14
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第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
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15
DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
2024/10/14
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4
三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
基因工程大题及解析
基因工程大题及解析基因工程可真是个超有趣又有点烧脑的领域呢。
下面就给大家分享一些基因工程的大题。
1. 基因工程中常用的工具酶有哪些？（10分）答案：基因工程中常用的工具酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶等。
限制性核酸内切酶能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。
DNA连接酶可以将两个具有相同黏性末端或者平末端的DNA片段连接起来。
DNA聚合酶可以用于DNA的合成，比如在PCR反应中，Taq DNA 聚合酶可以在引物的引导下合成新的DNA链。
2. 简述基因工程的基本步骤。
（15分）答案：基因工程的基本步骤包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
目的基因的获取可以通过从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或者人工合成等方法。
构建基因表达载体需要将目的基因与运载体（如质粒等）连接起来，一般要用到同一种限制性核酸内切酶和DNA连接酶。
把目的基因导入受体细胞有多种方法，例如将目的基因导入植物细胞可以用农杆菌转化法、基因枪法等，导入动物细胞可以用显微注射法等。
目的基因的检测与鉴定包括检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，检测目的基因是否转录出mRNA，检测目的基因是否翻译成蛋白质等。
3. 什么是基因文库？基因文库有哪些类型？（10分）答案：基因文库是指将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
基因文库包括基因组文库和cDNA文库。
基因组文库包含了一种生物的所有基因，而cDNA文库是通过反转录的方法，以mRNA为模板合成的cDNA构建的文库，它只包含了该生物的部分基因，即可以表达的基因。
4. 在基因工程中，如何筛选出含有目的基因的受体细胞？（15分）答案：可以利用标记基因来筛选。
例如，如果运载体上带有抗某种抗生素的标记基因，那么将目的基因导入受体细胞后，把受体细胞放在含有这种抗生素的培养基中培养，能够正常生长的受体细胞就很可能是含有目的基因的细胞。
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程期末考试题及答案
基因工程期末考试题及答案一、选择题（每题2分，共20分）1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 纤维素酶B. 限制性内切酶C. 淀粉酶D. 过氧化氢酶答案：B2. 下列哪项不是基因工程的基本步骤？A. 目的基因的获取B. 基因的表达C. 基因的克隆D. 基因的测序答案：D3. 基因枪法是一种：A. 植物转基因方法B. 动物转基因方法C. 微生物转基因方法D. 所有生物的转基因方法答案：A4. 重组DNA技术中，通常使用哪种质粒作为载体？A. 质粒DNAB. 线粒体DNAC. 核糖体RNAD. 染色体DNA答案：A5. 基因工程中，目的基因的表达通常需要：A. 启动子B. 终止子C. 增强子D. 所有选项答案：D二、填空题（每空2分，共20分）1. 基因工程是指按照人们的意愿，将不同来源的基因在体外构建杂合DNA分子，然后导入到活细胞和生物体内，以改变生物的遗传特性并取得新品种或新产品。
2. 基因工程中常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母菌和________。
答案：哺乳动物细胞3. 基因工程中，________是连接目的基因和载体DNA的关键酶。
答案：DNA连接酶4. 目的基因的表达需要________和________的协同作用。
答案：启动子；终止子5. 基因工程产品在医学领域的应用包括生产________、________和基因治疗等。
答案：重组蛋白；单克隆抗体三、简答题（每题10分，共30分）1. 请简述基因工程在农业中的应用。
答案：基因工程在农业中的应用主要包括提高作物的抗病性、抗虫性、抗旱性和提高作物的产量和品质。
例如，通过基因工程培育的抗虫棉可以减少农药的使用，提高棉花的产量和质量。
2. 基因工程在医学领域有哪些应用？答案：基因工程在医学领域的应用包括生产重组蛋白药物、单克隆抗体、基因治疗和疫苗开发等。
例如，利用基因工程技术生产的胰岛素可以治疗糖尿病，单克隆抗体用于治疗癌症和自身免疫性疾病。
3. 请解释什么是转基因生物，并简述其潜在的风险。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
第三章 基因工程工具酶
（3）牛血清蛋白 (BSA)
BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、 的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 的酶变性。 会引起电泳拖尾。
Ⅱ类 R-M 系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两 种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲 基化酶。 甲基化酶也称修饰酶 (modification enzyme)，用 来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶 （C）5- 氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限 制性内切酶识别而免于切割。
甲基化酶分两类： 甲基化酶分两类：
第三章 基因工程工具酶
基因工程工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， 是依赖一些酶 如限制性核酸内切酶，连接酶， 如限制性核酸内切酶 DN聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割 聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“ 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工 具酶” 工具酶是对野生菌株（ 具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如 酵母）进行改造、优化、 酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产 品。
DNA连接酶（ligase） 连接酶（ 连接酶 ）
能够催化 DNA 中相邻的 3’-羟基和 5’-磷酸 基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可 使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
生物技术课件-02基因工程常用工具酶
随着技术的不断发展，基因工程经历了从简单到复杂的过程，从最初的重组DNA技术到现在的基因编辑技术，基因工程的应用范围和影响力不断扩大。
医学领域
农业领域
工业领域
基础生物学研究
01
02
DNA聚合酶的最主要功能是催化脱氧核糖核酸链的合成。
DNA聚合酶存在于生物体的各种细胞中，包括原核生物和真核生物。其中最重要的有E· coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶α、β、γ等。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。
聚合酶
这类酶能够催化DNA的聚合反应，是PCR技术中常用的工具酶之一。根据来源不同，可以分为Taq酶和T7噬菌体聚合酶等。
工具酶的应用与展望
限制性核酸内切酶用于切割DNA，产生具有特定黏性末端的片段，连接酶将这些片段连接起来，形成重组DNA。
聚合酶用于DNA复制，通过检测特定基因的PCR产物，可以鉴定基因的存在和表达水平。
01
02
在基因工程中，末端转移酶可以用来在DNA片段的3'端加上多聚腺苷酸尾巴，从而增加外源基因在宿主细胞中的转录效率。
末端转移酶是一种能够将单个脱氧核糖核苷酸或脱氧寡核苷酸附加到核酸分子末端的酶。
工具酶的分类与特性
来源于动物细胞
这类工具酶是从动物细胞中提取得到的，如碱性磷酸酶、限制性核酸内切酶等。它们在基因克隆、DNA修饰等方面有广泛应用。
限制性核酸内切酶
这类酶能够识别并切割DNA的特异序列，是基因工程中常用的工具酶之一。根据识别序列的不同，可以分为限制性内切酶和特异性内切酶。
基因工程工具酶及其应用
基因工程工具酶及其应用基因工程工具酶，顾名思义就是我们用来“操作”基因的那些“利器”，就像是高科技的“剪刀”和“胶水”，专门用来“修修补补”DNA的。
可能你会想，这个听起来是不是太复杂了？其实不然，别看它名字高大上，搞不好你每天吃的菜、喝的牛奶里就藏着它们的身影。
基因工程工具酶，乍一听让人觉得神秘，但它们实际上跟我们的生活息息相关，甚至在一些药品、疫苗的生产中，都少不了它们的身影。
说白了，它们就是为我们生活提供方便的小助手，做事不露声色，却能起到大作用。
要说的就是“限制性内切酶”，这个名字一听就让人觉得高深莫测，但它其实是个“拆家伙”。
它们的任务就是识别DNA中的特定序列，然后像个“小剪刀”一样，把DNA在特定的位置剪开。
这就好比你在家里找到了一个搞破坏的小偷偷偷把你家的锁给撬开了，不过呢，这种“撬锁”可不是什么坏事，它反而能帮我们更好地了解基因结构，还能帮我们在实验室里搞“基因拼图”。
比方说，如果你想从一个复杂的基因组里找到一个你感兴趣的基因，限制性内切酶就能把DNA剪成小片段，再通过其他技术把需要的部分“提取”出来，哎，这可是一项不小的技术活儿。
然后，得说说“连接酶”，你可以把它当作是“超级胶水”。
我们知道，DNA是由一段段的核苷酸组成的，断了的DNA片段就像是没接上的拼图。
这个时候，连接酶就登场了，它们可以把这些断裂的DNA片段粘合在一起。
想象一下，你买的拼图掉了一块，结果就拿来一瓶超级胶水，把它们完美粘合。
就这么简单。
它们的作用可不小哦，如果没有这些“胶水”，那些修补过的基因就根本没办法发挥作用。
很多时候，我们需要通过“拼接”不同的基因片段，来合成新的基因。
这个时候，连接酶就像是一个细心的工匠，把那些“零碎”的DNA拼接成一个完整的“作品”。
再来说说“聚合酶”，这也是我们生活中常见的一位“幕后英雄”。
如果你做过PCR实验，你一定听说过它。
聚合酶就像一个“复制工厂”，它能在一定条件下，把DNA分子一个接一个地“复制”出来。
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
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46
b、3’ ---5’ 外切酶活性
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44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
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45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
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21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
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14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
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15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
基因工程试题及答案
基因工程试题及答案# 基因工程试题及答案## 一、选择题1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 限制性内切酶B. DNA聚合酶C. 逆转录酶D. DNA连接酶2. 基因工程中，用于目的基因的克隆通常使用：A. 质粒B. 噬菌体C. 人工染色体D. 转座子3. 下列哪项不是基因工程的应用领域？A. 农业改良B. 疾病治疗C. 能源开发D. 武器制造## 二、填空题1. 基因工程中，常用的宿主细胞包括________、________和________。
2. 基因枪法是一种________技术，可以将目的基因直接导入植物细胞。
## 三、简答题1. 简述基因工程的基本操作步骤。
2. 基因工程在医药领域的应用有哪些？## 四、论述题1. 论述基因工程对现代农业的影响及其潜在风险。
## 参考答案### 一、选择题1. 答案：A, D。
限制性内切酶和DNA连接酶是基因工程中用于切割和连接DNA片段的常用工具酶。
2. 答案：A。
质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆和表达目的基因。
3. 答案：D。
基因工程的应用领域广泛，但武器制造不属于其应用范围。
### 二、填空题1. 答案：大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞。
这些是基因工程中常用的宿主细胞，用于表达外源基因。
2. 答案：基因转移。
基因枪法是一种基因转移技术，通过高速微粒子将DNA射入细胞内。
### 三、简答题1. 答案：基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、载体的选择与构建、目的基因与载体的连接、转化宿主细胞、筛选含有目的基因的细胞、目的基因的表达与检测。
2. 答案：基因工程在医药领域的应用包括：生产重组蛋白药物、基因治疗、疫苗开发、疾病诊断等。
### 四、论述题1. 答案：基因工程对现代农业的影响主要体现在作物改良、提高产量、增强抗病虫害能力等方面。
通过基因工程，可以培育出抗旱、抗盐碱、抗病的作物新品种，提高作物的适应性和产量。
然而，基因工程也存在潜在风险，如基因流可能导致非目标物种的基因改变，以及转基因作物对生态环境的影响等。
基因工程基因工程工具酶
2023-11-03
目录
• 基因工程工具酶概述 • 基因工程工具酶的种类及应用 • 基因工程工具酶的生产及纯化 • 基因工程工具酶的发展趋势及挑战 • 基因工程工具酶的相关法规及伦理问题
01
基因工程工具酶概述
基因工程工具酶的定义
基因工程工具酶是指那些在基因工程实验中用于切割、修饰 、检测和操控DNA的酶。
详细描述
DNA连接酶可以连接DNA片段之间的缺口，实现DNA分子的拼接。在基因工程中，它被广泛应用于 基因克隆、载体构建、测序等实验中。根据来源不同，DNA连接酶具有不同的特性和应用范围。
逆转录酶
总结词
逆转录酶是一种能够将RNA转化为cDNA 的酶，是基因工程中重要的工具酶之一。
VS
详细描述
逆转录酶可以逆转录RNA分子，生成 cDNA分子。在基因工程中，它被广泛应 用于RNA测序、cDNA库构建、基因克隆 等实验中。根据来源不同，逆转录酶具有 不同的特性和应用范围。
03
基因工程工具酶的生产及 纯化
基因工程工具酶的生产
01
02
03
基因克隆
将目标酶的基因克隆到表 达载体中，构建成重组 DNA分子。
细胞转化
将重组DNA分子导入宿 主细胞，使目标基因在细 胞内表达。
培养基选择
选择适合细胞生长和酶表 达的培养基，优化培养条 件。
基因工程工具酶的纯化
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放出目标酶。
这些酶主要来自生物体内，但也可以通过基因工程技术进行 人工改造和优化。
基因工程工具酶的重要性
基因工程工具酶是实现基因操作的关键工具，没有它们，我们无法实现从DNA片 段到完整基因组的精确编辑。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
基因工程的工具酶
基因工程的工具酶⏹限制性核酸内切酶⏹DNA连接酶⏹DNA聚合酶⏹碱性磷酸酶⏹末端脱氧核苷酸转移酶限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶.是体外剪切基因片段的重要工具限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定防御机制：⏹任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制⏹人:免疫系统⏹细菌：限制与修饰系统寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限制性酶对修饰过的DNA不能起作用.这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制酶(restriction enzyme）修饰酶(modifying enzyme）核酸酶切位点：既可以在3ˊ，5ˊ—磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）,也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键1）核酸限制性内切酶的类型2）核酸限制性内切酶的基本特性3）同裂酶和同尾酶4）核酸限制性内切酶的命名法5）影响核酸限制性内切酶活性的因素限制性核酸内切酶的类型及特性按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同,分为三类：Ⅰ型Ⅱ型＊Ⅲ型第一类（I型）限制性内切酶:能识别专一的核苷酸顺序并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因如：Eco B、Eco K等第二类(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序）并在该顺序内的固定位置上切割双链是DNA重组技术中最常用的工具酶之一这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同⏹切割后形成具有粘性末端（cohesive end)的DNA片段⏹切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在识别序列的对称轴上切割,形成的DNA片段没有突出的单链第三类（III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链.但这几个核苷酸对不是特异性的。
基因工程的主要工具酶及其功能
基因工程的主要工具酶及其功能基因工程，听起来有点高大上是不是？不过，别紧张，其实它就是通过一些技术手段去“修修补补”我们基因里的东西，改改它们的“工作方式”。
你想想，就像是给手机换个更强大的处理器，或者把家里的WiFi升级成超速光纤，基因工程就是想通过这种方法让某些生物更强大、效率更高。
你可能会想，基因工程到底怎么做到的？答案就是：它有一堆超级厉害的工具，而这些工具的幕后英雄，正是酶。
对，就是那些在生物体内帮忙做各种“化学工作”的小能手。
酶是啥？简而言之，酶就是大自然的“万能钥匙”，它们能帮助我们剪、粘、拼接、修复、拆解基因链。
没有它们，基因工程可能就成了空谈。
所以，酶就是基因工程的“主力军”，它们有着不可或缺的地位。
就像我们上学时，如果没有老师的引导，知识就没法传授到我们手里；如果没有酶的帮助，基因操作也是无从下手。
首先要聊聊的是“限制性内切酶”，这是基因工程中最常见的一种酶，简直可以说是基因“剪刀”。
它的功能很简单却非常强大——它能在特定的DNA序列上找到并切割掉不需要的部分，哎呀，这就像你在看视频时用剪辑软件裁掉那些你觉得无聊的部分，留下一段精简有趣的内容。
限制性内切酶其实是自然界中细菌用来对抗病毒入侵的一种防御武器，它通过切割外来病毒的DNA来保护自己。
科学家们聪明地发现，利用这些“剪刀”可以方便地切割我们想要的DNA片段，从而为基因工程的“拼图”提供了素材。
要聊的是“连接酶”。
你可以把连接酶想成是基因工程中的“胶水”。
有了限制性内切酶剪出DNA片段之后，这些片段就需要拼接起来，才能形成新的基因。
连接酶就是做这件事的“能手”。
它能够把切开的DNA片段连接在一起，把它们重新合并成一个完整的基因，就像你把几块乐高积木拼成一个完整的房子。
没有连接酶，基因工程的“拼图”就无法完成，那些小小的DNA片段就只能任其散落一地，完全无法发挥作用。
可能有些人开始好奇，这些酶真的有那么神奇吗？当然啦！接下来我们要说的“聚合酶”，它是基因工程中的“扩音器”。
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4. 切割位点
5. 特异性切割 6. 基因克隆中
I型
II 型
单一多功能的酶 3种不同亚基
限制酶和修饰酶分开 单一成分
ATP、Mg2+和S-腺苷甲 硫氨酸 距特异性位点1000bp 不是 无用
Mg2+
特异性位点及其附近
是 非常有用
III 型
双功能酶 2种亚基
ATP、Mg2+和S-腺苷甲 硫氨酸 特异性位点3‘端2426bp处 是 有用
Bgl II 5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’ 3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’
5’ XXXXG GATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAG GXXXXXX 5’
1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表 示为Hin；
2、用1个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind，若酶存 在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子；
Xma I Sma I
5’…… C CCGGG ……3’ 5’…… CCC GGG ……3’
同序同切
同序异切
同尾酶（isocaudamer）：是指来源不同、识别序列也不同但切割后产生相同的粘性末端一 类限制酶。
经同尾酶消化的DNA末端连接示意图
BamH I 5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’ 3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’
1978年，W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获 得诺贝尔奖金。
截止到目前为止，已经分离出400余种II类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有100种，而实 验室常用的有20种。
3.1.2 限制性核酸内切酶的分类
1. 限制修饰活性 2. 内切酶的蛋白
CTGCAG GACGTC
• 什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，
这样的切口叫黏性末端。 3’粘性末端；5’粘性末端
5’
3’
练一练 C
B
5、原核 6、核苷酸 7、磷酸二酯键 8、黏性末端 9、平末端
3.1.5 限制性核酸内切酶的命名-1973 Smith和Nathams
感染 Eቤተ መጻሕፍቲ ባይዱcoli k
E .coli B (E .coli B 限制 λ（k）) 不感染 ② 仍有少量λ(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对λ(K)DNA
E.coli B
修饰
λ(k)*
感染
E.coli(B)- λ
细菌如何对λ噬菌体进行限制和修饰 ?
•细菌的限制—
① 1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对噬菌体的修饰是 在Phageλ的DNA上。
基因工程的工具酶
1
掌握：工具酶的特性和用途 1. 限制性核酸内切酶 2. DNA连接酶 3. DNA聚合酶 4. DNA修饰酶
重点：限制性核酸内切酶、DNA连接酶特性和用途 难点：限制性核酸内切酶、DNA连接酶特性和用途
应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针、载体构建、目的基因选取、 重组的、DNA制备等程序中所需要的酶类。主要是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，末端转移酶、单 链核酸酶和反转录酶。
3、切割位点的规范性: 双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘 性末端或平末端的DNA分子）。
4、识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用效果。
“切哪里”?
3.1.4 限制性内切酶的切割方式 限制性核酸内切酶－“分子手术刀”
磷酸二酯键
磷酸二酯键
脱氧核苷酸链
A
3、该菌株（种）中发现的不同的酶按照顺序以罗马字母编号I, II, III等。
3.1.6 同裂酶和同尾酶
同裂酶（isoschizomer）：是指来源不同的但却具有相同的识别序列，切割DNA后产生相同 末端（或不同末端）的一组限制酶。
Kpn I Asp 718
5’……GGTAC C……3’ 5’……GGTAC C……3’
② 1965年，Arber发现修饰与λ的降解有关，提出：细 胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即 细胞中有限制—修饰系统 (R-M Restriction-modification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
限制—修饰的酶学假说
酶切位点 不被修饰
酶切位点 被修饰 Methylation
3.1.3 II型限制性核酸内切酶的特点
1、识别位点的特异性: 每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4～8个核苷酸组成的特定序列 （靶序列）
例如： HindⅡ MboⅠ
5’ - GTPyPuAC – 3’ 5’ - GATC – 3’
GANC
2、识别序列的对称性: 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。
限制性核酸内切酶 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵
噬菌体DNA 被切割
基因组DNA 不被切割
1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得 DNA分子的体外精确切割成为可能。
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
所以把这些酶称为“基因工程工具酶”。 工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。
3.1 限制性核酸内切酶
3.1.1
细菌的限制-修饰系统
① 50年代后Luria和Human(1952) Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现 象：
Phageλ（k）