原花青素测定方法

原花青素测定方法

1. 电化学法

原理:

原花青素易以氢供体的形式捕获其它活泼的自由基形成多酚自由基。邻苯三酚在碱性水溶液中迅速发生自氧化链式反应，产生中间产物超氧阴离子自由基( O2 · - )。分子量大的多酚所形成的自由基较为稳定，可以发生偶合，形成聚合的多酚分子，同时发生竟争反应，使继续引发邻苯三酚自由基链式反应的趋势减弱或消失，表现为具有较强的清除自由基能力，且清除能力在一定的条件下与原花青素的加入量有线性关系，并随体系碱度的增大，羟基氢离子电离而增大。超氧阴离子自由基( O2- )被清除，自氧化链式反应被阻断，反应终止，使邻苯三酚在- 0. 96V( vs. SCE)的自氧化峰电流减小，故可以做为原花青素的定量测定方法。试验方法：

于5 mL比色管中，加入适量浓度的原花青素贮备液，0. 5 ml 0. 5 mol /L的Tris- HCI( pH= 8. 33)缓冲溶液，1. 0 mL5. 00 mmol /L邻苯三酚，定容刻度，摇匀。在1 min-6 min内，记录扫描电位在(- 0.8)—(- 1. 2V)范围内- 0. 96± 0. 02V处的二阶导数极谱波。

2.定量核磁共振法

原理:

定量核磁共振法以被测成分的特征氢核的共振吸收信号为目标进行分析，分析结果直观且准确性好。

原花青素通常是由表儿茶素及儿茶素通过4→8 位或4→6 位的碳-碳键连接，生成聚合度不同、空间结构十分复杂的混合物。但每个原花青素分子中只有一个末端单元，并且它的H-4位移变化不明显，因此可以用它来表征样品中原花青素分子的数量。

试验方法：

用微量天平精密称取内标物邻苯二甲酸氢钾约10 mg、样品约40 mg，加入DMSO-d 6为溶剂1 mL 使其充分溶解，转移到核磁管中进行1 H谱NMR 分析。检测条件：5 mm BBO 探头，600.192MHz，谱宽为12335.5 Hz，脉冲宽度为13 μs，采样时间为17 s，延迟时间为6 s，采样次数为16 次。

3.高效液相色谱串联质谱法

原理:

以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图，利用多重反应监测模式对原花青素组分进行定性和定量分析。

试验方法：

色谱条件：色谱柱Waters SunFire-C18柱(150 mm X 2. 1 mm X 5 um)；流动相：A为0. 1%甲酸水溶液，B为乙睛；流速0.25mL/min，柱温25℃；进样量3 uL，；梯度洗脱。

质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)，负离子扫描，多重反应监测，毛细管电压-3500V，雾化气压力350 kPa，干燥气温度350℃，干燥气流量6L/min，碰撞能量30 V 。

4.香草醛-HPLC结合法

原理:

原花青素和黄烷- 3- 醇单体的A环的化学活性较高，在酸性条件下，其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩和，产物在浓酸作用下形成红色的正碳离子，样品的浓度与产生的颜色呈正相关，在500 nm 波长下测定其吸光值。同时，利用HPLC法测定了主要的黄烷- 3-醇单体：儿茶素、表儿茶素的含量，以香草醛法测定的黄烷- 3-醇、原花青素总量减去HPLC 测定的2种单体总量之差代表样品中原花青素的含量。

试验方法：

香草醛法：比色条件的选择分别配制0.06mg/L 的原花青素、0.05 mg/L 的儿茶素标准品的甲醇溶液。各质量浓度的香草醛及不同体积分数的硫酸、盐酸均用甲醇作溶剂。反应体系：1 mL样品/甲醇+2.5 mL一定体积浓度的香草醛/甲醇+2.5 mL一定体积浓度的盐酸(硫酸)/ 甲醇，一定温度下反应一定时间后测定A 500。

HPLC 法：儿茶素、表儿茶素标准曲线的建立。色谱条件：UV 检测器，波长280 nm，流速1mL/min，上样量10 μL，柱温30 ℃。流动相：A，2%乙酸、9%乙腈水溶液；B，乙腈。梯度模式：0min→23 min→45 min→50 min→70 min，流动相A相应浓度梯度为100% →100% →75% →75% →100%。注入标准工作液，根据数据建立儿茶素、表儿茶素的线性曲线。稳定液：取0.5 g 抗坏血酸置于1 L 容量瓶中，加约500 mL 双蒸水，混合，溶解抗坏血酸，加入100 mL 乙腈，用双蒸水稀释至刻度。标准工作液：精确称取15 mg 儿茶素、20mg 表儿茶素，置于50 mL 容量瓶中，加入40 mL稳定液，超声波降解直至完全溶解，用稳定液稀释至刻度，得到标准贮备液。标准贮备液用稳定液稀释1∶2、1∶5、1∶10、1∶25、1∶50，得到标准工作液。

5.原子吸收法

原花青素能与碱式乙酸铅发生配合反应，产生难溶于水的棕黄色沉淀，经过滤分离后，用原子吸收法测定滤液中过量的铅离子，可间接测定原花青素含量。

6. 高效毛细管电泳法

以高电压电场为驱动动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间运动速度和分配系数的不同而实现分离的一类液相分离技术。毛细管电泳分离、分析葡萄原花青素，是用硼酸盐缓冲液使大量同分异构体和不同聚合度的原花青素分离，各带电粒子以柱塞状向前推移，通过检测器检测，得到电泳图谱。当硼砂- 磷酸盐缓冲液pH = 9，浓度为80 mmol/L 时，原花青素混合物的分离度和分离效果最好。通过解聚反应，将高聚体原花青素降解，原花青素的电泳分离效果得到明显改善，在20mmol/L的硼砂-磷酸盐缓冲液中也能得到良好的电泳图谱。与HPLC相比，毛细管电泳具有分析时间短、分离度好、成本低。