人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案

实验方案

实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析

一、实验目的

1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

2、初步掌握人类染色体 J带的显示方法及人类染色体 J带在染色体识别中的意义。

3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其识

别。

二、实验原理

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体

微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是

0.075mol/L的KCI）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气

干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转

化细胞。

染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构

变化。

在所有的显带技术中，G 显带（G banding ）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa 染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G 带（G band）。G 显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

正常人类染色体的数目为46条（23对），I960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1〜22号，性染色体用X和Y标记；

并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A〜G表示。

染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。

表1 人染色体组型及其特征

三、实验试剂与器材

试剂：抗凝剂：肝素溶液（500U/ml ）;

培养基：40,按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。

小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56 C水浴条件灭活。

植物血球凝集素（PHA：市售，按说明书要求使用5%NaHCO

秋水仙素：已有，1ug/ml，根据需要量取！

低渗溶液：0.075mol/L氯化钾班上同意配制，我们组负责配！

Carnoy固定液

Giemsa染液：磷酸缓冲液（pH6.8）10ml加Giemsa原液0.3ml，用时配制。

器材：光学显微镜1台，离心机1台，恒温水浴箱1台，恒温箱1台，离心管17支，量简2个，烧杯2只，培养瓶2个，载玻片8张，玻片架2台，注射器4支，枪头2支，移液枪2支，胶塞2个，标签纸1圈，碘酒和酒精棉球，酒精灯，1台，天平1台，普通冰

箱1台，立式染缸1个、染色架1个、镊子3个，直头小吸管14支、橡皮吸头14个、吸水纸若干，香柏油，擦镜纸，剪子1个，胶水。正常人类染色体G带核型图，核型报告纸

四、实验方法

（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；

每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：

RPMI1640 4ml

灭活小牛血清1ml

PHA 2.5mg

依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO调节培养基的pH

值至7.2-7.4。

（二）采血与培养：先以碘酒和75%^醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝

素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。转动针筒以混匀肝素

常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2〜3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.2〜0.3ml （6号针头45度倾斜，约20 滴）,盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37C恒温箱内静置培养72h。（每天摇

动培养瓶一次）

（三）秋水仙素处理：

向经恒温培养68-72 小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素，使其终浓度为

0.4ug/ml, 即每瓶（内装5ml 培养基）中用6 号针头倾斜45 度角滴4 滴，轻轻将液体摇匀，继续恒温培养3-4 小时。

（四）标本的制备:

1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀10 分钟（1000r/min），弃去

上清液。

2、加入37C预温的低渗液8m1,轻轻打匀，置37C水浴箱中20分钟。（使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。）

3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液 1 m1 进行预固定，混匀后，离心10分钟

（2000r/min）。

4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液4m1,轻轻吹打混匀，置室温15分钟。

5、离心沉淀1000 r/min ，10 分钟。

6、弃去上情液，再加入固定液4m1吹打均匀重悬细胞，固定10分钟。

7、离心沉淀1000 r/min ，10 分钟。

8、重复固定一次。

9、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液（0.3〜0.6m1），轻轻吹打成细胞悬液。

1 0 、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片1张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从30~40cm 高处滴

2 滴于玻片上，立即用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在酒精灯上略烘一下（勿全烘干，过火3-5 次），在空气中待干。

（四）染色：

1、滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染色

滴在片隙中，室温染色20 分钟；

2、自来水轻轻冲洗（冲洗标本片的背面）3〜5秒钟，晾干；

3、镜下观察染色体分带及染色情况。

五、实验结果

1、观察自己制作的标本片中染色体的形态、颜色及其显带情况，记录并说明原因。计数10 个细胞的染色体数。

2、试述染色体G显带技术在人类染色体识别中的意义。

3、绘出一套完整的中期分裂细胞的染色体图；

根据课堂提供的材料，排列初一份正常人类染色体G带核型图。