蛋白质样品的制备精品课件

4.样品制备过程中，防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.（加入 尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白)
5.防止样品在等电聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀
6.破坏蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用，以产生独立的 多肽链
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7.有的研究中必须保持蛋白质的活性。
8.通过超速冷冻离心等方法清除所有的非蛋白杂质，对可能起干 扰作用的高丰度或无关蛋白质也应去除
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二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
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5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
悬浮处理。
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4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
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（二）、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。
4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
胀而释放出细胞内容物。
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2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
求为止。
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3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
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三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这 会严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。 如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低 温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。 另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失 活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载 体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些 方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条 件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用 蛋白酶抑制剂。
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
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3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
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4. 机械匀浆法
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第一节 样品制备总则
一、为什么要进行蛋白质样品的制备
1.要从某些组织样品中寻找功能蛋白质，就 要排除非蛋白质的影响。
2.目前实验条件下，双向电泳能分辨到 1000-5000个蛋白质点（spot），而生物 的蛋白种类多达10万种以上，样品中的蛋 白质种类也可达到1万种以上，但大部分 蛋白质的拷贝数都很少，因此通过样品制 备也可以起到浓缩蛋白质的作用。
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1. 超声裂解法
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，
样品处理应在冰浴中进行。
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2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
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⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟）
是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L, 灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是 其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现 加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者 β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小， 因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。
第二章 蛋白质样品的制备
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蛋白质样品的制备是蛋白质组分析的基础 蛋白质样品制备包含：蛋白质分离、提取、纯化
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一 步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
9.样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反复冻
融已制备好的样品。
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三、流程
1.细胞或者组织、菌体的破碎 2.沉淀溶液样品中的蛋白质及清除杂质 3.蛋白质的纯化(重泡涨溶液稀释样品；三氯
乙酸+冷丙酮）
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第二节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
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（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例 如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物， 或者用于分析某一特定的细胞器，例如只 需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它 的细胞器。
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1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
3.消除各种细胞或组织混杂的影响
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二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理
2.尽可能的提高样品的溶解度，使所有待分析的蛋白质样品全部 处于溶解状态，且制备方法应具有可重现性。
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白 酶抑制剂以防止蛋白的降解。